一、产品简介
1.1 产品描述
Ni NTA Agarose Beads 6FF（货号：QS01002）是一种以6%高度交联琼脂糖微球为基质，共价偶联次氮基三乙酸（Nitrilotriacetic acid, NTA）螯合配基，并螯合Ni²⁺的固定化金属亲和层析（IMAC）介质。NTA作为四齿螯合剂，通过四个配位键与Ni²⁺牢固结合，剩余两个配位位点可与多组氨酸标签（6×His-tag）蛋白表面暴露的组氨酸咪唑侧链特异性相互作用，从而实现His标签重组蛋白的高选择性、高载量亲和纯化。
本产品采用高交联度6%琼脂糖基质，兼具优异的耐压性能与化学稳定性，耐受压力可达0.3 MPa（3 bar），支持较高流速操作，适用于实验室规模至工业中试规模的His标签蛋白快速纯化。
1.2 作用原理
琼脂糖微球 ── 间隔臂 ── NTA（四齿螯合）── Ni²⁺ ── His标签蛋白
↑
2个游离配位位点
（与组氨酸咪唑基结合）
NTA为四齿螯合剂，与Ni²⁺形成六个配位键中的四个，剩余两个配位位点可与6×His标签中相邻组氨酸残基的咪唑氮原子配位结合。结合在介质上的目标蛋白可通过咪唑竞争洗脱或降低pH值洗脱。
1.3 产品特点
• 高动态载量：动态结合载量（DBC）≥50 mg His标签蛋白/mL沉降介质，单次纯化即可获得高产量目标蛋白；
• 低Ni²⁺泄漏：NTA四齿螯合结构使Ni²⁺结合牢固，显著降低金属离子脱落，减少目标蛋白污染；
• 高流速与耐压：6%高交联琼脂糖基质，更大耐压0.3 MPa，推荐线性流速150–300 cm/h，适合快速纯化与工艺放大；
• 宽化学兼容性：兼容多种还原剂（DTT、β-巯基乙醇、TCEP等）、变性剂（8 M尿素、6 M盐酸胍）、非离子型去污剂及有机溶剂；
• 宽pH稳定性：工作pH 3–12，在位清洗（CIP）pH 2–14，可耐受0.1 M NaOH等严苛清洗条件；
• 多条件适用：支持天然（非变性）条件与变性条件下纯化，适用于可溶性蛋白及包涵体蛋白；
• 可再生重复使用：经剥离Ni²⁺、清洗、重新载镍后可多次循环使用，降低使用成本。
二、技术规格
项目 | 规格 |
基质（Matrix） | 6%高交联度球形琼脂糖 |
配基（Ligand） | 次氮基三乙酸（NTA），螯合Ni²⁺ |
外观 | 浅蓝色均一悬液 |
平均粒径 | 90 μm（粒径分布45–165 μm） |
动态结合载量（DBC, 10%穿透） | ≥50 mg 6×His标签蛋白/mL沉降介质 |
Ni²⁺结合容量 | 约15 μmol Ni²⁺/mL沉降介质 |
更大耐压 | 0.3 MPa（3 bar，约43 psi） |
推荐线性流速 | 150–300 cm/h |
重力流操作流速 | 0.5–2 mL/min（依柱径而定） |
更高线性流速 | ≥370 cm/h |
pH稳定性（工作） | 3–12 |
pH稳定性（CIP，短期） | 2–14 |
储存液 | 20%乙醇水溶液 |
储存温度 | 2–8 °C，避光 |
介质浓度 | 约50%悬液（沉降介质:储存液 = 1:1，v/v） |
三、储存与稳定性
1. 本产品以20%乙醇悬液形式提供，应于2–8 °C避光保存，切勿冷冻；
2. 未开封状态下，在规定储存条件下有效期为24个月；
3. 开封后建议在12个月内用完，每次使用后应及时更换储存液并于2–8 °C保存；
4. 避免介质长时间暴露于室温或强光下；
5. 已装填的层析柱若长期不用，应置换为20%乙醇后于2–8 °C保存。
四、应用领域
• 大肠杆菌、酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞表达系统中6×His标签重组蛋白的纯化；
• 可溶性胞内蛋白、分泌表达蛋白及包涵体变性蛋白的亲和捕获；
• 实验室规模蛋白功能研究、抗体制备、结构生物学研究；
• 工业中试及大规模重组蛋白生产工艺中的捕获步骤（Capture step）；
• 可与凝胶过滤、离子交换等层析步骤组合，实现多步纯化工艺。
五、纯化工艺
5.1 缓冲液配制通则
• 使用高纯度水（≥18.2 MΩ·cm）及分析纯以上级别试剂配制缓冲液；
• 缓冲液配制后建议经0.45 μm（或0.22 μm）滤膜过滤并充分脱气后使用；
• 咪唑母液（如3 M咪唑，pH 6.0）可提前配制，于4 °C保存；
• 所有缓冲液使用前确认pH值已校准至目标值±0.1。
5.2 天然（非变性）条件缓冲液配方
适用于可溶性His标签蛋白的纯化，可保持蛋白天然构象与生物活性。
缓冲液名称 | 配制体积 | 配方 |
裂解/平衡缓冲液（LE Buffer） | 1 L | 50 mM NaH₂PO₄（7.80 g NaH₂PO₄·2H₂O）；300 mM NaCl（17.54 g NaCl）；10 mM咪唑（0.68 g咪唑）；用NaOH调pH至8.0 |
洗杂缓冲液（Wash Buffer） | 1 L | 50 mM NaH₂PO₄（7.80 g NaH₂PO₄·2H₂O）；300 mM NaCl（17.54 g NaCl）；20 mM咪唑（1.36 g咪唑）；用NaOH调pH至8.0 |
洗脱缓冲液（Elution Buffer） | 1 L | 50 mM NaH₂PO₄（7.80 g NaH₂PO₄·2H₂O）；300 mM NaCl（17.54 g NaCl）；250 mM咪唑（17.0 g咪唑）；用NaOH调pH至8.0 |
提示：平衡/洗杂缓冲液中10–20 mM咪唑可有效减少非特异结合蛋白；若目标蛋白结合较弱，可将洗杂咪唑浓度降至10 mM。洗脱缓冲液中250 mM咪唑可洗脱大多数His标签蛋白；若洗脱不完全，可提高至500 mM咪唑，或采用pH 4.5的酸性缓冲液洗脱。纯化建议进行咪唑梯度洗脱（如20、50、100、250、500 mM）以确定更佳洗脱浓度。
5.3 变性条件缓冲液配方（咪唑洗脱）
适用于大肠杆菌包涵体蛋白的变性纯化。8 M尿素可替换为6 M盐酸胍（Guanidine-HCl）。
缓冲液名称 | 配制体积 | 配方 |
裂解/平衡缓冲液（LE Buffer） | 1 L | 100 mM NaH₂PO₄（15.60 g NaH₂PO₄·2H₂O）；10 mM Tris-HCl（1.21 g Tris，加980 mL水，用HCl调pH 8.0后定容）；8 M尿素（480.50 g尿素）；用NaOH调pH至8.0 |
洗杂缓冲液（Wash Buffer） | 1 L | 100 mM NaH₂PO₄（15.60 g NaH₂PO₄·2H₂O）；10 mM Tris-HCl（1.21 g Tris）；8 M尿素（480.50 g尿素）；10 mM咪唑（0.68 g咪唑）；用NaOH调pH至8.0 |
洗脱缓冲液（Elution Buffer） | 1 L | 100 mM NaH₂PO₄（15.60 g NaH₂PO₄·2H₂O）；10 mM Tris-HCl（1.21 g Tris）；8 M尿素（480.50 g尿素）；250 mM咪唑（17.0 g咪唑）；用NaOH调pH至8.0 |
5.4 变性条件缓冲液配方（pH梯度洗脱，可选）
对于部分在咪唑洗脱条件下效果不佳的蛋白，可采用pH梯度洗脱：
缓冲液名称 | 配方 | pH |
裂解缓冲液 | 8 M尿素，100 mM NaH₂PO₄，100 mM Tris-HCl | 8.0 |
洗杂缓冲液 | 8 M尿素，100 mM NaH₂PO₄，100 mM Tris-HCl | 6.3 |
洗脱缓冲液 | 8 M尿素，100 mM NaH₂PO₄，100 mM Tris-HCl | 4.5 |
注意：pH 4.5洗脱时Ni²⁺可能部分脱落，洗脱后应立即中和至pH 7.0–8.0，并及时对介质进行再生处理。
5.5 样品制备
5.5.1 胞内可溶性蛋白（大肠杆菌/酵母）
1. 4 °C、5,000–7,000 rpm（约5,000–7,500 ×g）离心10–15 min收集菌体；
2. 按1:10（w/v）比例用预冷的LE缓冲液重悬菌体，加入PMSF（终浓度1 mM）或其他蛋白酶抑制剂；
• 注意：所用蛋白酶抑制剂不得含EDTA、EGTA等金属螯合剂；
3. 冰浴超声破碎：超声1 s、间隔3 s，总超声时间约30–45 min（视菌体量调整），至菌液澄清不黏丝；
4. 可选：若裂解液过于黏稠，加入RNase A（终浓度10 μg/mL）和DNase I（终浓度5 μg/mL），冰浴孵育10–15 min；
5. 4 °C、12,000 rpm离心15–30 min去除细胞碎片，收集上清，经0.45 μm滤膜过滤后待上样。
5.5.2 分泌表达蛋白（培养上清）
1. 若培养上清中不含EDTA、组氨酸或高浓度还原剂，可直接上样或经0.45 μm过滤后上样；
2. 若含有上述干扰成分，需用1×PBS（pH 7.4）于4 °C充分透析后上样；
3. 对于大体积上清，可先经硫酸铵沉淀浓缩蛋白，沉淀用1×PBS溶解并透析后上样。
5.5.3 包涵体蛋白（大肠杆菌）
1. 按5.5.1步骤收集菌体并超声破碎；
2. 4 °C、12,000 rpm离心10–20 min，收集包涵体沉淀；必要时用1×PBS多次洗涤包涵体以去除杂蛋白；
3. 按约1:7.5–1:10（w/v）比例用变性LE缓冲液（含8 M尿素）重悬包涵体，室温孵育30–60 min，必要时辅以超声或均质处理以促进溶解；
4. 12,000 rpm离心30 min去除不溶物，收集上清待上样；
5. 变性条件下洗脱的蛋白需根据下游应用进行复性（稀释复性、透析复性或柱上复性）。
5.6 层析柱准备与平衡
1. 轻轻颠倒混匀介质瓶，使介质完全均一悬浮（避免剧烈搅拌产生气泡）；
2. 根据所需柱床体积量取适量介质悬液（介质悬液中沉降介质约占50%），转移至层析柱中；
3. 待介质自然沉降后，排干储存液；
4. 用3–5倍柱体积（CV）去离子水洗去乙醇；
5. 用至少5倍柱体积LE缓冲液平衡柱子，至流出液A280基线稳定且pH与上柱缓冲液一致。
5.7 上样、洗涤与洗脱
步骤 | 操作 | 推荐体积 | 流速 |
上样 | 将预处理后的澄清样品以恒定流速上柱，收集穿流液（Flow-through）留样分析 | 依样品量而定 | 0.5–1 mL/min（重力流）或150 cm/h |
洗涤 | 用洗杂缓冲液洗涤，至A280回到基线并稳定 | 8–15 CV | 同上 |
洗脱 | 用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，分部收集（每管0.5–1 CV） | 5–10 CV | 0.5–1 mL/min |
• 洗脱可采用一步洗脱（250 mM咪唑）、分步洗脱（如50、100、250 mM咪唑阶梯）或线性梯度洗脱（20–500 mM咪唑，20 CV以上）；
• 梯度洗脱可获得更高纯度，推荐用于对纯度要求较高的实验；
• 收集各洗脱峰组分，通过A280、SDS-PAGE或Western blot鉴定目标蛋白；
• 洗脱后根据下游应用，用20 mM Tris-HCl（pH 8.0）或1×PBS（pH 7.4）于4 °C透析去除咪唑。
5.8 层析柱装填（工业放大参考）
Ni NTA Agarose Beads 6FF具有良好的装填性能，适合中压层析柱装填及工艺放大。
1. 用装填缓冲液（如去离子水或0.9% NaCl）排除柱底及适配器气泡，确保柱网下无气泡滞留；
2. 关闭柱出口，保留柱网上方少量缓冲液；
3. 将介质悬液沿玻璃棒缓缓倾入柱内（或使用装填reservoir），避免引入气泡；
4. 连接泵并打开柱出口，先以低流速使介质沉降，再逐步提高流速至恒定压力约0.3 MPa（3 bar）进行装填；
5. 维持装填流速至少3个柱床体积，待柱床稳定后标记柱床高度；
6. 关闭出口，安装适配器并下压至标记处，再继续装填使柱床进一步压实；
7. 将适配器下调约2 mm压入柱床，锁紧后即可使用；
8. 后续层析操作流速不应超过装填流速的75%。
5.9 纯化结果分析
1. 取穿流液、洗涤液及各洗脱组分适量，与SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸变性5 min；
2. 进行SDS-PAGE电泳（推荐12%–15%分离胶），考马斯亮蓝染色或Western blot检测；
3. 通过条带分析评估目标蛋白纯度、回收率及杂蛋白残留情况；
4. 必要时测定A280计算蛋白浓度（注意咪唑在280 nm附近有微弱吸收，透析后测定更准确）。
六、在位清洗（CIP）
当层析柱反压升高、柱效下降或观察到明显污染时，应进行在位清洗（CIP），以去除沉淀蛋白、疏水性蛋白、脂蛋白及脂类等污染物。
6.1 常规CIP流程
1. 去除强疏水结合物、脂蛋白和脂类：用10倍柱体积的30%异丙醇洗涤，接触时间15–20 min，重复5–10次；
2. 用10倍柱体积去离子水冲洗；
3. 可选：用2倍柱体积含0.1%–0.5%非离子型去污剂的0.1 M醋酸溶液洗涤，接触1–2 h；去污剂处理后需用5倍柱体积70%乙醇彻底去除残留去污剂；
4. 去除沉淀蛋白：用2–3倍柱体积0.1–0.5 M NaOH洗涤，接触时间30–60 min（不超过1 h）；
5. 用10倍柱体积去离子水冲洗至中性；
6. 用至少5倍柱体积起始缓冲液重新平衡。
6.2 注意事项
• CIP后若介质颜色变浅或变白，提示Ni²⁺脱落，需按"介质再生"流程重新载镍；
• 0.1 M NaOH清洗后应立即用水冲洗并平衡，避免介质长时间处于极端pH；
• 建议每5–10次纯化后进行一次CIP，具体频率视样品洁净程度而定。
七、介质再生与重新载镍
为完全恢复介质性能，可按以下流程进行彻底再生（剥离Ni²⁺→清洗→重新载镍）：
步骤 | 溶液 | 体积 |
1 | 6 M盐酸胍（或8 M尿素），0.2 M醋酸 | 2 CV |
2 | 去离子水 | 5 CV |
3 | 2% SDS溶液 | 3 CV |
4 | 去离子水 | 5 CV |
5 | 乙醇 | 5 CV |
6 | 去离子水 | 5 CV |
7 | 100 mM EDTA（pH 8.0）——剥离Ni²⁺ | 5 CV |
8 | 去离子水 | 5 CV |
9 | 100 mM NiSO₄溶液——重新载镍 | 5 CV |
10 | 去离子水（洗去游离Ni²⁺） | 10 CV |
• 载镍后介质应恢复均匀的浅蓝色；若颜色不均或偏浅，可重复步骤9–10；
• 再生后的介质如长期保存，应置换为20%乙醇，于2–8 °C避光保存；
• 介质可耐受多次再生循环，实际使用次数取决于样品性质与CIP/再生操作规范。
八、故障排除
问题 | 可能原因 | 解决方法 |
目标蛋白产量低或检测不到 | 蛋白表达量过低 | 优化表达条件（诱导温度、IPTG浓度、诱导时间） |
His标签因蛋白折叠未暴露 | 尝试变性条件下纯化；或更换标签位置（N端/C端） | |
上样量不足或上样流速过快 | 增加上样量；降低上样流速至0.5 mL/min | |
洗涤条件过严，目标蛋白被洗出 | 用LE缓冲液（含10 mM咪唑）替代洗杂缓冲液；降低洗涤咪唑浓度 | |
洗脱不充分 | 提高洗脱咪唑浓度（至500 mM）；降低洗脱pH至4.5；增加洗脱体积 | |
蛋白与介质结合过强 | 用10–100 mM EDTA或EGTA剥离Ni²⁺并洗脱蛋白 | |
蛋白被降解 | 全程4 °C操作；加入足量蛋白酶抑制剂（避免EDTA类） | |
上样/平衡缓冲液中含EDTA等螯合剂 | 透析去除螯合剂后再上样 | |
洗脱组分中出现多条杂带 | 洗涤不充分 | 增加洗杂缓冲液体积；提高洗涤咪唑浓度（至30–40 mM） |
非特异杂蛋白共洗脱 | 尝试咪唑梯度或pH梯度洗脱；在洗脱前增加pH 5–6的高严谨洗涤步骤 | |
样品中含富组氨酸杂蛋白 | 采用二次纯化（如换用其他类型介质）；优化梯度洗脱条件 | |
介质未充分再生 | 按再生流程彻底清洗并重新载镍 | |
柱床变白/颜色变浅 | 缓冲液中螯合剂（EDTA、EGTA、柠檬酸等）剥离了Ni²⁺ | 避免在上样/洗涤缓冲液中使用螯合剂；按再生流程重新载镍 |
柱压升高/流速变慢 | 样品中颗粒物堵塞柱床 | 样品上样前经0.45 μm滤膜过滤；进行CIP清洗 |
脂蛋白或沉淀蛋白污染 | 按CIP流程清洗，必要时用30%异丙醇处理 | |
柱床中有气泡 | 重新装填柱子；缓冲液充分脱气 | |
洗脱液呈蓝/绿色 | Ni²⁺脱落进入洗脱液 | 检查缓冲液是否含螯合剂；降低洗脱pH不要过低；洗脱后透析去除Ni²⁺；介质重新载镍 |
蛋白在穿流液中检出 | 上样流速过快 | 降低上样流速 |
标签未暴露或标签丢失 | 变性条件纯化；检查构建序列确认标签完整性 | |
介质载量已饱和 | 增加介质用量；减少上样量 |
九、化学兼容性
Ni NTA Agarose Beads 6FF在以下试剂条件下稳定（室温短期接触）：
类别 | 兼容试剂及浓度 |
还原剂 | 1 mM DTT；5 mM DTE；20 mM β-巯基乙醇；5 mM TCEP-HCl；10 mM还原型谷胱甘肽 |
变性剂 | 8 M尿素；6 M盐酸胍（Gua·HCl） |
去污剂 | 2% Triton X-100；2% Tween 20；2% NP-40；1% CHAPS；2%胆酸盐 |
盐类 | 2 M NaCl；4 M MgCl₂；5 mM CaCl₂；100 mM Na₂SO₄ |
其他添加剂 | 50%甘油；20%乙醇；1 mM EDTA（短期）；60 mM柠檬酸钠（短期）；500 mM咪唑 |
清洗试剂 | 0.1 M NaOH（≤1 h）；0.01 M HCl；70%乙酸（≤12 h）；2% SDS（≤1 h）；30%异丙醇（≤30 min） |
注意：
- 高浓度EDTA、EGTA、柠檬酸等强螯合剂会导致Ni²⁺脱落，应避免在平衡/洗杂缓冲液中使用；
- DTT浓度建议不超过1 mM，高浓度还原剂可能影响Ni²⁺结合；
- 如需使用强变性剂或去污剂，使用后应立即按CIP/再生流程处理介质。
十、注意事项
1. 本产品仅供科研使用，不得用于人体、临床诊断或治疗用途；
2. 操作时请穿戴适当的实验服、手套和护目镜；
3. NiSO₄溶液具有刺激性，避免直接接触皮肤和眼睛；如不慎接触，立即用大量清水冲洗；
4. 咪唑粉末具有刺激性，称量时建议在通风橱中操作并佩戴口罩；
5. 介质不可冷冻、不可干燥，冻融会导致琼脂糖微球破裂；
6. 避免使用磁力搅拌器剧烈搅拌介质，以免破坏微球结构；
7. 不同蛋白的更佳纯化条件存在差异，使用建议进行条件优化（咪唑浓度梯度、pH、流速等）；
8. 变性条件纯化后的蛋白如需复性，应注意缓慢去除变性剂以减少蛋白聚集；
9. 本产品批次间可能存在细微色差，属正常现象，不影响产品性能；
10. 请在有效期内使用，过期产品可能出现载量下降或Ni²⁺泄漏增加。
十一、订购信息
产品名称 | 货号 | 规格 |
Ni NTA Agarose Beads 6FF | QS01002 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL / 500 mL / 1 L |
Ni IDA Agarose Resin 6FF | QS01001 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL / 500 mL |
Ni TED Agarose Resin 6FF | QS01003 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL / 500 mL |
HP Ni TED Agarose Resin FF | QS01004 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL |
Co-NTA Agarose Beads 6FF | QS01005 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL |
Co-TED Agarose Beads 6FF | QS01006 | 10 mL / 25 mL / 50 mL / 100 mL |
大包装及工业级定制规格请联系千株松技术支持。
十二、联系方式
• 地址：江苏省镇江市宝华镇仙林东路16号双创大厦1207室
• 官网：www.qianzhusong.com
• 技术支持：请通过官网或销售渠道联系我们的技术团队，（17302508337，微信同号）
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