一、 产品概述
HP Ni NTA Agarose Beads 6FF 是一款高流速、高耐压的固定化金属离子亲和层析（IMAC）介质，专为重组组氨酸标签（His-tag）蛋白的高效纯化而设计。产品以高度交联的6%琼脂糖（6FF）为基质，偶联有12个原子的亲水性长间隔臂，末端固定次氮基三乙酸（NTA）螯合的镍离子（Ni²⁺）。该设计极大降低了空间位阻，使介质对His标签蛋白的动态结合载量突破性达到 > 35 mg/mL，且可承受 0.5 MPa 的高工作压力，支持更高流速和更快纯化进程。
本产品适用于实验室级别的小量制备，也完全适用于中试及生产规模的柱层析系统，能够配合ÄKTA等各类层析设备使用。
二、 核心特点
超高结合载量：10% 动态穿透载量（DBC）≥ 35 mg（His-tag 蛋白）/mL 介质，减少介质用量，提高单次纯化产量。
12原子间隔臂：专利亲水性长间隔臂设计，将NTA配基充分延伸至流动相，有效消除琼脂糖骨架的空间屏蔽，大幅提高对融合标签以及大分子量蛋白的可及性。
优异的机械强度：基于6%高度交联琼脂糖（6 Fast Flow）基架，更高工作压力可达 0.5 MPa（5 bar），支持高达 500 cm/h 以上的线性流速，显著缩短纯化周期。
低非特异性吸附：亲水性的基架与间隔臂，极大降低宿主细胞蛋白、核酸等杂质的非特异性结合，提高纯化纯度。
稳定的镍离子螯合：NTA四齿配位结构提供稳定的Ni²⁺结合力，在合适的操作条件下金属离子脱落率极低，保证介质可多次重复使用。
宽泛的化学耐受性：兼容常见高浓度盐、变性剂（6 M Gua-HCl、8 M Urea）、去垢剂及还原剂（低浓度），并可经受0.5-1.0 M NaOH在位清洗。
可重复性与可放大性：粒径分布和批次间一致性好，无缝放大至生产规模，满足从研发到GMP生产的全流程需求。
三、 技术参数
参数 | 规格 |
基质 | 高度交联6%琼脂糖（6 Fast Flow） |
颗粒分布 | 50–100 μm |
配基 | Ni²⁺ 螯合次氮基三乙酸（NTA） |
间隔臂原子数 | 12个原子（亲水性长间隔臂） |
动态结合载量（DBC 10%） | > 35 mg/mL |
更大工作压力 | 0.5 MPa (5 bar) |
工作pH范围 | 6.0–8.5（连续使用，以保持Ni²⁺稳定） |
工作温度 | +4°C 至 30°C |
储存缓冲液 | 20% 乙醇水溶液 |
推荐柱床高度 | 5–20 cm（实验室），10–30 cm（工业生产） |
四、 配基与间隔臂结构
NTA通过一个由12个碳、氧、氮原子组成的亲水性长链（即12原子间隔臂）共价偶联于琼脂糖骨架上。长间隔臂极大提升了配基的摆动自由度和空间可达性，尤其有利于纯化以下目标：
大分子量蛋白：空间位阻降低，使柔性较差的巨型His标签融合蛋白同样具备高结合量。
内部或C端His标签蛋白：标签若部分掩埋，长臂NTA更容易探入蛋白表面裂隙实现结合。
多亚基复合物：间隔臂为复合物提供了足够空间，减少因立体排斥导致的回收率下降。
Ni²⁺经由NTA的四齿螯合（三个羧基氧和一个叔胺氮），保留一个开放的配位位点可逆地结合组氨酸咪唑基团，从而实现温和洗脱与高纯度纯化。
五、 应用领域
重组His-tag蛋白、多肽的实验室纯化及高通量筛选
结构生物学样品的快速制备（兼容变性纯化）
疫苗与抗体片段的捕获步骤（Capture step）
酶、激素、细胞因子的大规模生产纯化
需要原位复性（On-column refolding）的包涵体蛋白
六、 操作指南
6.1 缓冲液配制
结合/平衡缓冲液（pH 7.4-8.0）
50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，300–500 mM NaCl，10–40 mM 咪唑
可根据蛋白稳定性加入 5% 甘油、1-5 mM β-巯基乙醇或0.1% Tween 20。
洗脱缓冲液
结合缓冲液中加入 250–500 mM 咪唑，pH 调至 7.4–8.0。
变性结合/洗脱缓冲液
100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris·HCl，8 M 尿素或6 M 盐酸胍，pH 8.0。相应洗脱缓冲液加入250–500 mM 咪唑。
所有缓冲液建议经0.45 μm滤膜过滤并脱气后使用。
6.2 样品制备
细胞裂解液经12,000 g离心或微滤，完全去除颗粒物。
补加NaCl至300–500 mM，咪唑至10–40 mM（抑制杂蛋白结合）。
避免带入EDTA、EGTA等强螯合剂（即使微量也会剥离Ni²⁺）。
对于含高浓度还原剂的样品，需降至5 mM以内，或选用变性纯化流程。
调节pH至7.4–8.0，导电性与结合缓冲液保持一致。
6.3 装柱与平衡
充分摇匀HP Ni NTA Beads浆液，按所需柱体积量取一定沉降介质。
使用与层析柱配套的装柱器，将介质在结合缓冲液中匀浆后一次性倒入柱管。
在 0.3–0.5 MPa 下恒压填装，最终柱床稳定后将适配器压至凝胶表面上2–3 mm。
用5–10个柱体积（CV）结合缓冲液平衡至流出液pH及电导与平衡液一致（流速建议150 cm/h）。
6.4 上样
控制样品上样流速在 100–200 cm/h，保证足够停留时间（约2–4分钟保留时间）。
上样量根据DBC值估算，建议初次上样不超过预期DBC的80%。
收集流穿液以备SDS-PAGE分析，避免超载。
6.5 洗涤与洗脱
洗涤：上样后用5–10 CV结合缓冲液清洗至UV基线平稳，可提高咪唑至30–50 mM去除弱结合杂蛋白。
洗脱：采用一步梯度洗脱（洗脱缓冲液）或线性梯度（20–500 mM 咪唑）。收集洗脱峰。
洗脱后立即用缓冲液置换或透析除去咪唑（如使用脱盐柱），防止长期存放蛋白失活。
6.6 在位清洗（CIP）
定期清除沉淀蛋白、脂类及强结合杂质，建议每3–5次使用后执行：
2–3 CV 2 M NaCl（去除离子交换结合的杂质）
2 CV 1% Triton X-100 或 0.5% 非离子去污剂（去脂）
3–5 CV 0.5 M NaOH（去蛋白沉淀、内毒素、微生物），接触时间30–60分钟
立即用10 CV纯水冲洗至中性
6.7 再生与重新挂镍
当介质颜色变浅或结合载量显著下降时，需剥离并重新螯合Ni²⁺：
5 CV 100 mM EDTA, pH 8.0 脱去Ni²⁺（柱会变为白色）
10 CV 纯水冲洗
2–3 CV 0.1 M NiSO₄ 溶液流过或静态孵育，使介质恢复蓝绿色
5 CV 纯水洗去游离镍离子
结合缓冲液再次平衡即可使用
6.8 保存
长期储存：用5 CV 20%乙醇水溶液置换，置于4–8°C，严禁冻结。
七、 化学兼容性与稳定性
试剂类型 | 浓度 / 条件 | 兼容性 |
变性剂 | 8 M 尿素 | 兼容（工作及清洗） |
6 M 盐酸胍 | 兼容 | |
去污剂 | 1% Triton X-100, NP-40, Tween 20 | 兼容 |
还原剂 | ≤5 mM DTT, β-巯基乙醇 | 短期暴露兼容（避免长期>10 mM） |
TCEP ≤2 mM | 需评估，低浓度短期可兼容 | |
螯合剂 | EDTA, EGTA | 严禁使用（导致Ni²⁺剥离） |
NaOH | 0.5–1.0 M | 兼容（在位清洗） |
盐 | 2 M NaCl, 0.5 M Na₂SO₄ | 完全兼容 |
有机溶剂 | 30% 乙醇, 20% 异丙醇 | 兼容，可用于清洗与保存 |
酸 | pH ≥ 3.0 | 可短暂接触以去除特殊污染物 |
八、 常见问题与解决
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
载量低于预期 | 样品中存在螯合剂或高浓度还原剂；标签掩埋；柱床装填不均匀 | 透析除EDTA，降低DTT浓度；提升咪唑洗涤浓度；重新装柱，检查上样流速 |
洗脱峰拖尾严重 | 咪唑浓度不足或洗脱速度过快；柱效降低 | 增加咪唑至500 mM，降低洗脱流速；执行CIP或再生 |
镍离子脱落（蓝绿色变浅） | 操作pH过低、存在还原剂或螯合剂；反复长时间使用 | 检查样品缓冲液；执行再生重新挂镍 |
纯化蛋白含杂带 | 非特异性结合或宿主蛋白金属结合 | 提高结合缓冲液咪唑至20-40 mM；添加适量Tween 20和甘油；增加高盐洗涤步 |
背压过高 | 样品颗粒堵塞，蛋白沉淀，微生物污染 | 样品高速离心/过滤；执行NaOH在位清洗；介质保存时严格添加抑菌剂 |
九、 订购信息
产品名称 | 规格 |
HP Ni NTA Agarose Beads 6FF | 25 mL |
100 mL | |
500 mL | |
1 L | |
5 L（定制） |
可根据需要提供预装柱规格（1 mL、5 mL预装柱）以及散装介质。
相关产品
预装柱 HP Ni NTA 6FF 1 mL/5 mL
重力空柱及配套滤片
Ni²⁺ 溶液再生试剂盒
脱盐/缓冲液置换柱系列
十、 安全与储存
介质悬浮于 20% 乙醇 中，请于 4–8°C 密封保存，远离火源和氧化剂。
避免反复冻融，冻融破坏琼脂糖骨架。
操作时佩戴手套与护目镜。Ni²⁺ 溶液对皮肤和呼吸道有刺激，再生及重新挂镍时应在通风橱内进行。
废弃介质及含镍溶液需按所在地区法规进行无害化处理。
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