耐碱蛋白A琼脂糖填料预装重力柱纯化手册

目的： 本手册提供使用蛋白A琼脂糖填料重力预装柱（Gravity Pre-packed Column）从复杂样品（如细胞培养上清、腹水、血清）中纯化抗体（主要是IgG）的标准操作流程。该流程基于重力流原理，无需特殊设备。

一、所需材料与试剂

1. 耐碱蛋白A琼脂糖重力预装柱： (常见规格：1mL,      5mL)

2. 样品： 含有目标抗体的澄清溶液（需离心和0.45μm或0.22μm滤膜过滤）。

3. 缓冲液 (所有缓冲液需用0.22μm或0.45μm滤膜过滤并脱气)：

• 平衡缓冲液 (Binding/Wash Buffer)： 常用20-50       mM 磷酸钠或Tris-HCl, 100-150 mM NaCl, pH 7.0-8.0。(示例：20 mM 磷酸钠,       150 mM NaCl, pH 7.4)

• 洗杂缓冲液 (Wash Buffer)： 通常与平衡缓冲液相同。可增加严格性（如加入低浓度盐或去垢剂）。

• 洗脱缓冲液 (Elution Buffer)： 常用低pH缓冲液。

• 酸性洗脱 (常用)： 0.1        M 甘氨酸-HCl, pH 2.5-3.5 或 0.1 M 柠檬酸, pH 2.5-3.5。

• 中性洗脱 (可选)： 高浓度MgCl₂溶液。

• 中和缓冲液： 1       M Tris-HCl, pH 8.0-9.0 (用于中和酸性洗脱液，防止抗体变性)。

• 再生缓冲液 (Regeneration Buffer)： 常用0.1-0.5       M NaOH。

• 保存缓冲液 (Storage Buffer)： 常用20%乙醇 (溶于纯水或平衡缓冲液)，含0.05%叠氮化钠 (NaN₃, 剧毒，注意安全)       或其它抑菌剂。

4. 收集管/瓶： 用于收集流穿液、洗杂液、洗脱液。

5. 紫外分光光度计或蛋白检测试剂： 监测洗脱峰。

6. pH计： 配制和验证缓冲液pH。

7. 计时器、标记笔、冰盒、防护眼镜、手套等。

二、操作流程

重要提示：

• 整个操作建议在冷室（4°C）或室温（15-25°C）进行，保持温度一致。

• 操作中切勿让柱床干涸。

• 始终让缓冲液液面略高于柱床顶部，避免空气进入填料。

• 依靠重力自然流下，不要加压。可通过调节柱出口阀门或夹子控制流速（推荐流速：0.5 - 2 mL/min）。

• “柱体积 (CV)” 指预装柱中填料的体积（如1mL柱的1CV=1mL）。

1. 柱准备与平衡

1）将预装柱垂直固定在铁架台上。

2）打开柱顶盖和底端出口盖/塞子，让储存液流尽（收集废弃液）。

3）用至少5-10 CV 平衡缓冲液冲洗柱子。目的是置换储存液并使填料环境（pH, 离子强度）适合抗体结合。

4）让平衡缓冲液流尽，液面降至刚好接触柱床表面时关闭出口。

2. 样品上样 (Load)

1）将准备好的澄清样品轻轻加到柱床表面，避免扰动床面。

2）打开出口，让样品依靠重力缓慢流经柱床。目标抗体会结合到蛋白A填料上。

3）收集流穿液 (Flow-through)。可保留用于分析结合效率。

4）样品上样完成后，用少量（约0.5-1 CV）平衡缓冲液冲洗上样管/样品瓶内壁，并将冲洗液加入柱床顶部。

3. 洗杂 (Wash)

1）用大量洗杂缓冲液（至少10-15 CV）冲洗柱子。

2）目的：洗去未结合或弱结合的杂蛋白、核酸、色素等。

3）持续冲洗直至紫外吸收值（A280）降至稳定的基线水平（接近零）。

4）让洗杂液流尽，液面降至刚好接触柱床表面时关闭出口。

4. 洗脱 (Elution)

1)准备接收管：在收集管中加入适量中和缓冲液（如每1mL洗脱液预先加入100μL 1M Tris, pH 9.0），用于立即中和酸性洗脱液，保护抗体活性。

2)加入洗脱缓冲液（通常3-5 CV）。

3)打开出口，缓慢收集流出的洗脱液（目标抗体在此步被洗脱）。立即将收集的洗脱液与管中的中和缓冲液混合。

4)密切监测紫外吸收值（A280），收集出现明显蛋白峰的洗脱液（通常集中在1-2 CV内）。

5)洗脱完成后，让洗脱液流尽，液面降至刚好接触柱床表面时关闭出口。

5. 柱再生与平衡 (Regeneration & Re-equilibration)

1)用3-5 CV 再生缓冲液 (如0.1M NaOH)冲洗柱子。目的是去除强结合的杂质，彻底清洁填料。

2)保持NaOH在柱内接触5-15分钟。

3)用至少5-10 CV 纯水冲洗柱子，去除NaOH。

4)用至少5-10 CV 平衡缓冲液重新平衡柱子，使其恢复至结合状态，准备下次使用或保存。

6. 柱保存 (Storage)

1)用3-5 CV 保存缓冲液 (如含20%乙醇的平衡缓冲液或纯水) 冲洗柱子。

2)关闭柱顶端盖和底端出口盖/塞子。

3)在柱上明确标记保存液成分和日期。

4)4°C冷藏保存。

三、关键参数与优化建议

• 样品预处理： 离心和过滤至关重要，防止堵塞柱子。样品pH和离子强度应接近平衡缓冲液。

• 结合载量： 不同填料的动态结合载量（DBC）不同（通常10-50 mg IgG/mL填料）。避免过载。小规模预实验确定更佳上样量。

• 流速： 重力流较慢，确保足够接触时间（0.5-2 mL/min）。过快会导致结合不完全。

• 洗杂严格性： 如杂蛋白多，可在洗杂缓冲液中加入低浓度盐（如0.5M NaCl）或温和去垢剂（如0.1% Tween-20）。

• 洗脱pH： 常用低pH洗脱。优化pH值（如2.5, 3.0, 3.5）以平衡洗脱效率和抗体稳定性。洗脱后立即中和。

• 洗脱峰监测： 强烈建议用紫外监测（A280）或在线检测，收集目标峰。

• 再生强度： NaOH浓度和处理时间根据填料耐受性调整。强再生能延长柱寿命但可能影响填料稳定性。

四、注意事项

1. 安全！ 操作NaOH、酸性洗脱液、叠氮化钠时务必佩戴防护眼镜、手套，在通风橱内进行。妥善处理废液。

2. 避免气泡： 所有缓冲液需脱气。操作中防止空气进入柱床。

3. 避免干柱： 始终保证液面覆盖柱床。

4. 切勿加压！ 重力预装柱不能承受泵压。

5. 样品清洁： 确保样品充分澄清，防止堵塞和污染填料。

6. 缓冲液新鲜： 使用新鲜配制并正确过滤、脱气的缓冲液。

7. 保存条件： 按建议在4°C保存于含抑菌剂的缓冲液中。长期不用需定期更换保存液。

8. 柱子寿命： 遵循正确的再生和保存步骤，柱子通常可重复使用多次（10-50次或更多，取决于样品清洁度和操作）。

9. 优化： 本手册为通用流程，针对特定抗体或样品，可能需要优化缓冲液pH、离子强度、洗杂和洗脱条件。

请根据您使用的具体蛋白A琼脂糖预装柱产品说明书进行调整和优化！