Glutathione Agarose Beads 4FF （GST标签蛋白纯化填料凝胶介质）

1. 产品简介

千株松生物的 Glutathione Agarose Beads 4FF (QS01012) 是专门用于分离纯化 GST 标签蛋白、谷胱甘肽 S - 转移酶 (GST) 或谷胱甘肽依赖性蛋白的亲和层析介质。

本产品以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过 12 个原子的间隔臂共价结合还原型谷胱甘肽 (GSH) 配基。这种结构设计使介质具有优异的物理化学稳定性，能够耐受较高的操作压力和流速，特别适合从实验室小规模到工业大规模的蛋白纯化应用。

产品特点

• 一步纯化：特异性强，通常一步纯化即可获得纯度> 90% 的目标蛋白

• 高载量：每毫升介质可结合> 10mg GST 标签蛋白 (40kDa)

• 高流速：更大流速可达250cm/h，显著缩短纯化时间

• 易于放大：线性放大性能优异，从实验室到生产规模无需重新优化工艺

• 温和洗脱：使用还原型谷胱甘肽进行竞争性洗脱，避免蛋白变性，完整保留蛋白的生物学活性

• 长使用寿命：良好的化学稳定性，可多次再生使用

应用范围

• 原核表达系统 (大肠杆菌) 中 GST 标签融合蛋白的纯化
• 真核表达系统 (酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞) 中 GST 标签融合蛋白的纯化
• 天然谷胱甘肽 S - 转移酶的分离纯化
• 谷胱甘肽依赖性蛋白的分离纯化
• 蛋白 - 蛋白相互作用研究 (Pull-down 实验)
• 蛋白 - DNA 相互作用研究

2. 技术参数

3. 纯化原理

谷胱甘肽 S - 转移酶 (GST) 是一种来源于日本血吸虫的酶，由 211 个氨基酸组成，分子量约为 26kDa。GST 的活性中心能与还原型谷胱甘肽 (γ- 谷氨酰 - 半胱氨酰 - 甘氨酸) 形成高度特异性的非共价复合物，解离常数 (Kd) 低至 10⁻⁶M。

当靶蛋白与 GST 标签融合表达时，融合蛋白会保留 GST 的酶活性和底物结合特性。将含有融合蛋白的样品通过固定有还原型谷胱甘肽的层析柱时，GST 标签会与介质上的谷胱甘肽配基特异性结合，而其他杂蛋白则随流穿液流出。

用平衡缓冲液充分洗涤去除非特异性结合的杂蛋白后，加入含有过量游离还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液。游离的谷胱甘肽会竞争性地与 GST 标签结合，从而将融合蛋白从介质上洗脱下来。

如果需要去除 GST 标签，可以在融合蛋白的 GST 标签与靶蛋白之间设计特异性蛋白酶识别位点 (如凝血酶、肠激酶、PreScission 蛋白酶等)，纯化后用相应的蛋白酶进行酶切，再通过二次层析去除 GST 标签和蛋白酶。

4. 标准操作流程

4.1 溶液制备

• 平衡液 (PBS，pH7.3)：0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na₂HPO₄、0.0018M KH₂PO₄

• 洗脱液：0.05M Tris-HCl、0.01M 还原型谷胱甘肽，pH8.0

• 再生缓冲液 1：0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl、0.1% SDS，pH8.5

• 再生缓冲液 2：0.1M 醋酸钠、0.5M NaCl、0.1% SDS，pH4.5

4.2 样品制备

1. 样品所在溶液的 pH 和电导应与平衡液保持一致，可通过透析、超滤或 G25 脱盐柱进行缓冲液置换
2. 样品上样前必须进行澄清处理：
• 平均粒径 < 45µm 的样品：用 0.22µm 滤膜过滤

• 45µm < 

  平均粒径 < 165µm 的样品：用 0.45µm 滤膜过滤
• 平均粒径 > 165µm 的样品：用 0.8µm 滤膜过滤
3. 对于细胞裂解液样品，建议在 4℃下 12000×g 离心 30 分钟，取上清液进行过滤
4. 注意：本产品仅适用于可溶性蛋白的纯化，不能用于纯化溶解于高浓度变性剂中的包涵体蛋白

4.3 中压层析系统操作

1. 采用液滴对液滴的方式将柱子连接到层析系统上，避免引入气泡
2. 用纯化水冲洗 5 个柱体积 (CV)，去除保存液中的乙醇
3. 用平衡液冲洗 10 个柱体积，直至紫外吸收值和电导值稳定
4. 将样品以 1ml/min (约 30cm/h) 的流速上样，收集流穿液用于后续分析
5. 用平衡液冲洗 10-15 个柱体积，直至紫外吸收值回到基线
6. 用洗脱液洗脱 10 个柱体积，分步收集洗脱峰
7. 纯化完成后，按照 "填料再生" 或 "在位清洗" 的步骤处理介质

4.4 重力柱操作

1. 轻轻颠倒瓶子使介质完全悬浮，用移液管吸取适量介质浆液到重力流柱中
2. 静置待介质自然沉降，打开柱下端出口，让保存液自然流出
3. 加入 10 倍柱体积的平衡液，让液体自然流出，重复平衡 2-3 次
4. 关闭柱下端出口，加入处理好的样品，轻轻混匀
5. 室温下孵育 30 分钟，期间每隔 5 分钟轻轻颠倒混匀一次
6. 打开柱下端出口，收集流穿液
7. 加入 10 倍柱体积的平衡液洗涤，收集洗涤液
8. 加入 5 倍柱体积的洗脱液，室温下孵育 5-10 分钟
9. 打开柱下端出口，收集洗脱液，即为纯化的 GST 标签蛋白

4.5 批量纯化操作

1. 取适量介质浆液到离心管中，500×g 离心 5 分钟，弃去上清液
2. 加入 10 倍柱体积的平衡液，轻轻混匀，500×g 离心 5 分钟，弃去上清液，重复 2 次
3. 加入处理好的样品，轻轻混匀
4. 室温下在摇床上缓慢孵育 30 分钟

5. 500×g 离心5 分钟，小心弃去上清液 (流穿液)

6. 加入 10 倍柱体积的平衡液，轻轻混匀，500×g 离心 5 分钟，弃去上清液，重复洗涤 3 次
7. 加入 5 倍柱体积的洗脱液，轻轻混匀
8. 室温下在摇床上缓慢孵育 5-10 分钟

9. 500×g 离心5 分钟，小心收集上清液，即为纯化的GST 标签蛋白

5. 在位清洗 (CIP)

当介质使用多次后，或出现流速下降、结合能力降低、非特异性结合增加等情况时，需要进行在位清洗以去除强结合的杂质。

标准 CIP 流程

1. 用 2 个柱体积的 1M NaOH 溶液以 100cm/h 的流速冲洗，接触时间不少于 30 分钟
2. 用 5 个柱体积的纯化水冲洗
3. 用 2 个柱体积的 4M 尿素或 3M 盐酸胍溶液冲洗
4. 用 5 个柱体积的纯化水冲洗
5. 用 2 个柱体积的 70% 乙醇或 30% 异丙醇溶液冲洗
6. 用 5 个柱体积的纯化水冲洗
7. 用 10 个柱体积的平衡液重新平衡柱子

特殊污染物清洗

• 沉淀或变性蛋白：用2 个柱体积的6M 盐酸胍清洗，然后用5 个柱体积的平衡液清洗

• 疏水缔合物质：用2 个柱体积的70% 乙醇清洗，然后用5 个柱体积的平衡液清洗

• 脂类物质：用 2 个柱体积的30% 异丙醇清洗，然后用5 个柱体积的平衡液清洗

6. 填料再生

每次使用后都应进行填料再生，以保持介质的性能和使用寿命。

常规再生流程

1. 用 5 个柱体积的再生缓冲液 1 (0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl、0.1% SDS，pH8.5) 冲洗
2. 用 5 个柱体积的纯化水冲洗
3. 用 5 个柱体积的再生缓冲液 2 (0.1M 醋酸钠、0.5M NaCl、0.1% SDS，pH4.5) 冲洗
4. 用 5 个柱体积的纯化水冲洗
5. 用 10 个柱体积的平衡液重新平衡柱子
6. 如果不立即使用，用 5 个柱体积的 20% 乙醇冲洗，然后保存在 20% 乙醇中

注意事项

• 正确再生的介质可重复使用至少 5 次而不影响蛋白的产量和纯度
• 纯化不同的融合蛋白时，必须进行完整的再生流程以防止样品交叉污染
• 当介质的结合能力下降到初始值的 70% 以下时，建议更换新的介质

7. 常见问题及解决方案

8. 试剂兼容性表

9. 安全注意事项

• 本产品仅用于科研目的，不得用于临床诊断或治疗
• 操作时应穿戴适当的个人防护装备 (实验服、手套、护目镜)
• 避免接触皮肤、眼睛和黏膜，如不慎接触，立即用大量清水冲洗

• 20% 

  乙醇保存液具有易燃性，应远离火源
• 实验废弃物应按照实验室规定进行处理
• 还原型谷胱甘肽对光敏感，洗脱液应现配现用并避光保存

10. 储存与运输

• 储存条件：4-30℃密封保存于20% 乙醇水溶液中

• 运输条件：常温运输

• 保质期：在规定的储存条件下，保质期为2 年

• 注意事项：

• 避免冷冻，冷冻会导致介质结构破坏
• 避免阳光直射
• 使用后的介质应保存在 20% 乙醇中，每 3 个月更换一次新鲜的保存液
• 长期不用的柱子应密封保存，防止乙醇挥发和微生物生长

11. 订购信息

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