rProtein A Agarose Beads 4FF（货号：QS01008）是一款高性能亲和层析介质，专为单克隆抗体、多克隆抗体及Fc-融合标签蛋白的分离与纯化设计，广泛应用于生物制药、分子生物学研究、临床检测等领域。本产品以高度交联的4%琼脂糖微球为基质，共价偶联重组Protein A配体，经优化工艺制备而成，兼具高结合载量、高特异性、高流速及良好的化学稳定性，可实现目的蛋白的一步高效纯化，大幅提升实验效率与产物纯度。
重组Protein A由大肠杆菌高效表达，去除了天然Protein A中与白蛋白及细胞表面结合的非必需结构域，仅保留五个高亲和力IgG结合区域（Ka=10⁸/M），能显著降低非特异性吸附，确保纯化产物的高纯度与高活性。基质采用高度交联技术，可耐受较高操作压力，适配重力柱、中压层析等多种操作模式，满足实验室小规模纯化与工业化中试、生产等不同场景需求。
• 高结合载量：对人IgG的结合载量约30 mg/ml基质，能高效捕获样品中的目的蛋白，减少介质用量与实验成本。
• 高特异性：重组Protein A仅特异性结合哺乳动物IgG的Fc片段，不结合人IgM、IgD、IgA及狗IgG，非特异性吸附极低，纯化产物纯度可达95%以上。
• 优良的物理化学稳定性：基质高度交联，粒径均匀（45-165 μm），机械强度高，可耐受0.3 MPa（3 bar）操作压力，流速可达≤500 cm/h；在pH 3.0-10.0范围内稳定，可耐受常用缓冲液及变性剂（如6 M盐酸胍、8 M尿素），适配多种洗脱条件。
• 操作便捷：可直接用于重力柱装填或适配各类层析系统，纯化流程简单快捷，整个操作周期约30分钟（取决于样品体积与粘稠度），且介质可重复使用，结合能力无明显损失。
• 安全稳定：无动物源性成分，降低交叉污染风险；储存条件温和，2-8℃冷藏保存即可，无需冷冻，便于长期储存与使用。
参数名称 | 具体规格 |
产品名称 | rProtein A Agarose Beads 4FF |
基质 | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体 | 大肠杆菌表达的重组Protein A（含5个IgG结合域） |
粒径范围 | 45-165 μm |
结合载量 | 约30 mg hIgG/ml 基质 |
操作压力 | ≤0.3 MPa（3 bar） |
工作pH范围 | 3.0-10.0 |
化学稳定性 | 耐受所有常用缓冲液，6 M盐酸胍，8 M尿素，0.1 M氢氧化钠 |
推荐流速 | 重力流，100-300 cm/h；中压层析≤500 cm/h |
储存缓冲液 | 含20%乙醇的1×PBS缓冲液（pH 7.4） |
储存温度 | 2-8℃（严禁冷冻） |
用途 | 哺乳动物IgG、Fc-融合蛋白的分离、纯化及免疫沉淀（IP）实验 |
实验前需提前配置以下缓冲液，所有缓冲液均需用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，去除杂质与气泡，避免堵塞介质或影响纯化效果。
4.1 平衡液（Binding/Wash Buffer）
配方：0.02 M PB + 0.15 M NaCl，pH 7.0-7.4；或直接使用1×PBS缓冲液（pH 7.4）。
用途：平衡介质至与样品一致的缓冲体系，保护目的蛋白活性，同时去除介质表面的保护液。
4.2 洗脱液（Elution Buffer）
推荐配方（二选一）：
• 0.1 M 柠檬酸缓冲液，pH 3.0
• 0.1 M 甘氨酸-HCl缓冲液，pH 3.0
用途：通过降低pH值，破坏Protein A与IgG Fc片段的结合，实现目的蛋白的洗脱。
4.3 中和液（Neutralizing Buffer）
配方：1.0 M Tris-HCl，pH 8.5-9.0。
用途：洗脱组分需立即用中和液调节至中性（pH 7.0-7.4），避免低pH环境破坏目的蛋白的生物活性，推荐用量为洗脱组分体积的1/10。
4.4 清洗液（Cleaning Buffer）
l 去沉淀/变性物质：6 M 盐酸胍溶液
l 去疏水性杂蛋白：70%乙醇或1% Triton X-100溶液
l 在位清洗：0.1 M 氢氧化钠溶液
1 样品缓冲液调整：确保样品所在缓冲液与平衡液一致，可通过透析、超滤或G25凝胶过滤进行缓冲液置换；若样品为血清、腹水或细胞培养液，可直接用平衡液稀释至合适浓度。
2 样品澄清处理：样品在上样前需进行离心（12000 rpm，4℃，10 min），去除沉淀；随后用滤膜过滤（粒径＜45 μm用0.22 μm滤膜，45-165 μm用0.45 μm滤膜，＞165 μm用0.8 μm滤膜），避免微小固体颗粒堵塞介质或影响结合效率。
3 样品浓度调节：若样品中抗体浓度过高（＞2 mg/ml），可用平衡液稀释至1-2 mg/ml，避免浓度过高影响柱效与结合效果。
本产品可适配重力柱法、孵育法及中压层析法，以下为最常用的重力柱法操作流程，操作过程中需避免引入气泡，所有溶液用量均按柱体积（CV）计算。
6.1 重力柱装填（若使用散装介质）
1 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量去离子水润洗柱管与垫片，关闭下出口。
2 将rProtein A Agarose Beads 4FF混悬液轻柔颠倒摇匀，用枪头吸取适量浆液加入柱管中（填料实际体积占悬液的1/2），打开下出口，流干保护液。
3 加入适量去离子水冲洗填料，待液体重力流干后，关闭下出口；装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之间无空隙且保持水平。
6.2 平衡
向装填好的重力柱中加入5个柱体积的平衡液，开启下出口，让平衡液自然流干，重复2-3次，直至柱床pH与电导率稳定（与平衡液一致），使介质处于与样品相同的缓冲体系。
6.3 上样
将预处理好的样品缓慢加入平衡后的柱中，控制流速，使样品保留时间至少2 min，确保目的蛋白与介质充分结合；可反复上样1-2次，提高结合效率，收集流出液（流穿液），用于SDS-PAGE检测结合情况。
6.4 洗杂
加入10-15个柱体积的平衡液（洗杂液），缓慢流干，去除介质表面非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，可通过SDS-PAGE检测洗杂效果，直至洗脱峰基线平稳。
6.5 洗脱
加入5-10个柱体积的洗脱液，分段收集洗脱组分，每1个柱体积收集1管，分别检测（如紫外吸收法，OD280 nm）；收集所有有吸收峰的组分，立即向每管洗脱液中加入1/10体积的中和液，轻柔混匀，调节pH至中性，防止目的蛋白变性。
6.6 介质再生与保存
1 再生：洗脱完成后，加入3个柱体积的平衡液冲洗介质，再加入5个柱体积的去离子水平衡，可重复使用（推荐使用次数不超过10次），若结合效率下降，需进行在位清洗。
2 保存：再生后的介质，加入5个柱体积的20%乙醇溶液，密封柱管，置于2-8℃冷藏保存；长期不使用时，需定期检查保护液，若出现浑浊、沉淀等污染迹象，需更换保护液或丢弃。
当介质出现流速变慢、结合载量下降或杂蛋白吸附增多时，需进行在位清洗，去除介质表面的沉淀、变性蛋白及疏水性杂质，恢复介质性能。
1 去除沉淀/变性物质：用2个柱体积的6 M盐酸胍溶液冲洗介质，停留5 min，然后立即用5个柱体积的平衡液（pH 7.4）冲洗，直至pH与电导率稳定。
2 去除疏水性杂蛋白：用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的1% Triton X-100溶液冲洗，然后立即用5个柱体积的平衡液冲洗，直至基线平稳。
3 深度清洗：用0.1 M氢氧化钠溶液缓慢冲洗不少于5个柱体积，然后用去离子水冲洗至pH中性，再用平衡液平衡后，即可重新使用或保存。
常见问题 | 可能原因 | 解决方案 |
流速变慢 | 1. 筛板堵塞；2. 介质被蛋白/杂质堵塞；3. 样品未过滤，含微小固体颗粒 | 1. 清洗或更换筛板；2. 按第7部分进行在位清洗；3. 样品重新离心、过滤后上样 |
洗脱组分中无目的蛋白 | 1. 上样量过载；2. 样品pH/缓冲液不合适，结合力弱；3. 洗脱条件不当；4. 抗体降解或沉淀 | 1. 减少上样量；2. 调整样品pH至7.0-7.4，用平衡液置换缓冲液；3. 降低洗脱液pH至2.5-3.0，增加洗脱体积；4. 优化样品保存条件，避免高温、过酸过碱 |
目的蛋白回收率低 | 1. 上样流速过快，结合不充分；2. 洗杂不彻底，杂蛋白竞争结合；3. 介质载量下降 | 1. 降低上样流速，延长保留时间；2. 增加洗杂体积，直至基线平稳；3. 对介质进行在位清洗，若无效则更换新介质 |
纯化产物纯度低 | 1. 样品未预处理，杂蛋白过多；2. 洗杂不彻底；3. 非特异性吸附增加；4. 柱床装填不均 | 1. 样品重新离心、过滤，必要时进行预处理；2. 增加洗杂体积和次数；3. 检查样品缓冲液，避免高浓度变性剂；4. 重新装填柱床 |
介质载量下降明显 | 1. 使用次数过多，配基脱落；2. 杂质长期积累，未及时清洗；3. 操作条件超出耐受范围 | 1. 更换新介质；2. 定期进行在位清洗；3. 严格遵循操作pH、压力及流速要求 |
1 本产品仅用于科研、工业生产，不用于临床诊断或治疗。
2 介质从2-8℃取出后，需在室温下恢复至室温，再轻柔摇匀，避免温度骤变产生气泡或破坏介质结构。
3 操作过程中，所有缓冲液和样品需避免引入气泡，气泡会影响介质与蛋白的结合，降低纯化效率。
4 洗脱液为低pH溶液，具有腐蚀性，操作时需佩戴手套、护目镜等防护用品，避免接触皮肤和黏膜。
5 介质不可冷冻，冷冻会导致琼脂糖基质破裂，丧失结合能力；储存过程中需密封，防止污染和保护液挥发。
6 配基对低pH敏感，洗脱后需尽快用中和液调节pH，且低pH洗脱时间不宜过长，以延长介质使用寿命。
7 不同种属、亚型的IgG与Protein A的结合能力存在差异，使用前可参考相关文献，优化实验条件。
8 实验结束后，所用器皿需用去离子水清洗干净，避免残留缓冲液或蛋白影响后续实验。
产品名称 | 货号 | 用途 |
rProtein A Agarose Beads 4FF | QS01008 | IgG、Fc-融合蛋白纯化 |
耐碱rProtein A Agarose Beads 4FF | QS01007 | 高碱环境下IgG纯化 |
rProtein G Agarose Beads 4FF | QS01009 | 不同亚型IgG纯化 |
平衡液/洗脱液套装 | 定制 | 配套纯化使用，无需自行配置 |
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