rProtein A Agarose Beads 4FF（蛋白A填料凝胶介质，抗体纯化填料）

一、   产品简介与作用原理

蛋白 A 为金黄色葡萄球菌来源重组蛋白，含 5 个 IgG 高亲和力结合结构域，可特异性结合多种哺乳动物 IgG Fc 段。本产品将重组蛋白 A 共价偶联于 4FF 琼脂糖微球，机械强度高、非特异性吸附低，既可用于生物制药级抗体批量纯化，也适配细胞 / 组织样本 Co‑IP 蛋白互作验证实验。

二、   核心技术参数表

三、   产品规格与储存条件

4.1 包装规格

5 mL、10 mL、50 mL、100 mL、500 mL

4.2 储存要求

1. 未开封：4–8 ℃避光保存，禁止冻存，冻融将破坏琼脂糖微球刚性结构；

2. 开封使用后：补加 20% 乙醇至终浓度，4–8 ℃密封存放；

3. 长期不用填料：每 3 个月更换一次 20% 乙醇保护液。

四、   产品优势

1. 高特异性：重组蛋白 A 纯度高，杂蛋白污染低，Co‑IP      实验背景条带少；

2. 超高载量：≥30 mg 人 IgG/mL 填料，少量珠子即可完成 IP/Co‑IP；

3. 机械性能优异：4% 高刚性琼脂糖，耐受高速离心、反复洗涤不易破碎；

4. 耐强碱清洗：0.1 M NaOH 在位再生，可重复使用数十次，降低实验成本；

5. 通用性强：适配人、兔、猪、小鼠等多物种 IgG，兼顾纯化与互作实验。

五、   应用场景

1. 哺乳动物单克隆 / 多克隆抗体规模化分离纯化；

2. 免疫沉淀 IP：单一靶蛋白富集；

3. 免疫共沉淀 Co‑IP：验证细胞内蛋白‑蛋白相互作用。

六、   标准操作方案

6.1 抗体大规模纯化方案

本方案适用于重力柱、低压层析系统，处理细胞上清、血清、腹水等含 IgG 样品。

6.1.1 试剂准备

1. 结合缓冲液（Binding      Buffer）：20 mM Tris‑HCl，150 mM NaCl，pH 7.4；

2. 洗涤缓冲液（Wash Buffer）：同结合缓冲液；

3. 洗脱缓冲液（Elution      Buffer）：0.1 M Glycine‑HCl，pH 2.7‑3.0；

4. 中和缓冲液：1 M Tris‑HCl，pH 8.0；

5. 在位清洗液（CIP）：0.1 M NaOH；

6. 储存液：20%（v/v）乙醇水溶液。

6.1.2 填料装柱与平衡

1. 充分颠倒摇匀      rProtein A Agarose Beads 4FF 悬液，按照目标柱体积取出填料；

2. 将填料缓慢倒入层析柱，让填料自然沉降；重力柱可依靠重力沉降；层析系统可低流速压实，操作压力不超过      0.3 MPa；

3. 去掉 20% 乙醇保护液，使用 5‑10 倍柱体积结合缓冲液平衡层析柱，流速控制≤500 cm/h，流出液 pH 与电导率与结合缓冲液一致即平衡完成。

小提示：柱体积 V，5V 代表 5 倍柱体积；例如 5 mL 填料，5V 即为 25 mL 缓冲液。

6.1.3 上样

1. 样品预处理：细胞上清、腹水、血清建议 12000 g 离心除去沉淀，0.45 μm 滤膜过滤；样品 pH 尽量调至 7.0‑7.8；含盐量偏低样品可补加 NaCl 至 150 mM；

2. 将样品上柱，控制流速；根据载量，每毫升填料上样总 IgG 不高于 50 mg；

3. 收集穿透液，可留样检测 IgG 是否穿透，判断填料是否过载。

6.1.4 洗涤除杂

上样结束后，使用 8‑10 倍柱体积的洗涤缓冲液冲洗柱子，洗去未结合、非特异性吸附的杂蛋白，直到流出液 OD280 回到基线附近。

6.1.5 抗体洗脱

1. 加入洗脱缓冲液洗脱结合的 IgG；一般使用 3‑5 倍柱体积洗脱液；

2. 提前在收集管中加入 1/10 体积 1 M Tris‑HCl pH 8.0 中和缓冲液，收集洗脱组分，避免抗体长时间处于低 pH 导致变性；

3. 监测 OD280，合并高吸收峰组分，即为粗纯化      IgG；

4. 洗脱后立即用结合缓冲液把柱子 pH 回调至中性。

6.1.6 样品后处理

收集得到的抗体组分，可以透析、超滤置换到 PBS 或者目标储存缓冲液；0.22 μm 过滤除菌后 4℃短期保存或者‑20℃分装冻存。

6.2 Co‑IP 免疫共沉淀完整实验方案

6.2.1 实验试剂与耗材准备

1. 试剂配制（临用现加 PMSF / 蛋白酶抑制剂鸡尾酒）

‑ 裂解缓冲液（Lysis Buffer，温和型，保护蛋白互作）：50 mM Tris‑HCl pH7.5、150 mM NaCl、1% Triton X‑100、1 mM EDTA、1 mM NaF、1 mM Na₃VO₄；临用前加 1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂；

‑ 洗涤缓冲液 Wash Buffer：同裂解液，不含抑制剂；

‑ 中和液：1 M Tris‑HCl pH8.0；

‑ 酸性洗脱液：0.1 M Glycine‑HCl pH2.7；

‑ 5×SDS 蛋白上样缓冲液；

‑ 同型对照 IgG（与 IP 一抗宿主种属一致）；

‑ 特异性靶蛋白一抗；

1. 耗材：1.5 mL 低温离心管、剪去宽口枪头、4℃旋转混匀仪、低速离心机；

2. 填料预处理：充分颠倒混匀      rProtein A Agarose Beads 4FF，吸取所需体积（常规每样本 20‑40 μL 填料悬液），用裂解缓冲液洗涤 3 次，每次 1000 g 离心 1 min，弃上清备用。

6.2.2 细胞 / 组织蛋白样本制备

1. 细胞：弃培养基，预冷 PBS 洗细胞 2 次，加入裂解液冰上裂解 20‑30 min，每 5 min 轻晃一次；

2. 组织：剪碎后加裂解液冰上充分研磨，裂解 30 min；

3. 裂解液 4 ℃、12000 g 离心 15 min，小心吸取上清（避免吸入沉淀）；

4. BCA 法测定蛋白浓度，取 20‑30 μL 上清作为 Input 对照，加入 5× 上样缓冲液煮沸 5 min，‑20 ℃保存备用。

6.2.3 预清除（Pre‑clearing，降低非特异性结合，推荐必做）

1. 剩余蛋白上清加入等量同种属普通      IgG（1 μg/1 mg 总蛋白）+ 预处理好的 Protein A 琼脂糖珠（20 μL）；

2. 4 ℃旋转摇床温和孵育 30‑120 min；

3. 1000 g 离心 3 min，小心吸取上清至新离心管，弃去珠子沉淀，完成预清除。

6.2.4 抗体结合与免疫共沉淀

1. 将预清除后的上清分为两组：IP 实验组、IgG 阴性对照组；

2. 实验组加入特异性一抗（0.5‑2 μg 抗体 / 1 mg 总蛋白），对照组加入等量同种属普通 IgG；

3. 4 ℃旋转混匀过夜孵育；

4. 向两组体系中分别加入预处理完成的      rProtein A Agarose Beads 4FF（20‑40 μL）；

5. 4 ℃旋转摇床孵育 2‑4 h，使抗体‑靶蛋白‑互作蛋白复合物结合至填料。

6.2.5 填料洗涤（去除非特异杂蛋白）

1. 1000 g 离心 1 min，彻底吸弃上清；

2. 每管加入 1 mL 预冷 Wash Buffer，轻柔颠倒重悬珠子，4 ℃翻转孵育 5 min；

3. 1000 g 离心 1 min      弃上清，重复洗涤 4‑5 次；

注意：全程禁止剧烈涡旋，琼脂糖珠易碎，导致背景升高。

6.2.6 蛋白复合物洗脱（两种方案按需选择）

方案 A：变性洗脱（直接 WB 检测，最常用）

1. 洗涤后完全吸净洗涤液，加入 20‑30 μL 1×SDS 上样缓冲液重悬珠子；

2. 95 ℃沸水浴煮样 5 min；

3. 瞬时离心取上清，即可进行      SDS‑PAGE 与 Western Blot 检测互作蛋白。

方案 B：酸性温和洗脱（保留蛋白天然构象，用于质谱 / 功能实验）

1. 珠子中加入 50 μL 0.1 M 甘氨酸洗脱液（pH2.7），室温轻摇 5 min；

2. 1000 g 离心 1 min，吸取上清至新管，立即加入      1/10 体积 1 M Tris pH8.0 中和；

3. 如需完全洗脱，重复洗脱 1 次，合并洗脱液；

4. 洗脱产物可直接用于质谱、体外功能实验，如需 WB 可加入上样缓冲液煮沸。

6.2.7 Co‑IP 实验关键对照设置

1. Input 组：验证样本内存在靶蛋白与候选互作蛋白；

2. IgG 对照组：排除填料、抗体非特异性吸附杂蛋白；

3. 空白珠子对照（可选）：仅填料 + 裂解液，判断琼脂糖珠本身吸附背景。

七、   填料再生、在位清洗与保存

适用于抗体纯化柱以及 Co‑IP 回收的琼脂糖珠

1. 完成洗脱之后，使用 3‑5 倍柱体积 0.1 M NaOH 进行在位清洗（CIP），接触填料时间控制 30 min；

2. 大量 PBS 或者结合缓冲液冲洗填料，直至流出液      pH 回到中性；

3. 短期待用：可置于 PBS+0.02% 叠氮钠，4‑8℃保存；

4. 长期储存：换成 20% 乙醇水溶液，4‑8℃避光保存；

5. Co‑IP 使用过的珠子：若样品杂质多，建议增加 NaOH 浸泡时间；如果出现大量蛋白沉淀，建议丢弃，不建议重复使用。

重要提醒：不要让 NaOH 长时间（>2h）浸泡填料，会降低蛋白 A 配基活性。

八、   注意事项

1. 吸取琼脂糖珠时枪头剪去，防止戳碎微球；

2. Co‑IP 全程      4 ℃低温操作，避免蛋白复合物解离；

3. 高浓度去污剂、强还原剂会破坏蛋白 A 与 IgG 结合；裂解液中 SDS 浓度不可超过 0.1%；

4. 填料严禁冷冻，冻融后微球碎裂，载量大幅下降；

5. Co‑IP 洗涤步骤充分，否则会出现大量非特异杂带；

6. 抗体纯化上样样品更好过滤，颗粒杂质会堵塞层析柱，造成压力升高；

7. 不要使用强氧化剂，会破坏蛋白 A 配基和琼脂糖基质。

九、   常见问题排查

9.1 抗体纯化相关

1. IgG 收率低：样品 pH 偏离 7.0‑7.8、上样过载、配基失活、样品杂质堵塞填料；检查平衡、上样条件，做 NaOH 再生。

2. 洗脱抗体纯度差：洗涤不充分；增加洗涤体积；可适当提高洗涤缓冲液盐浓度。

3. 柱压异常升高：样品未过滤带入颗粒；填料被微生物污染；填料破碎。

9.2 Co‑IP 实验相关

1. 无目的条带：抗体效价不足、蛋白互作较弱、裂解液破坏复合物、孵育时间不足；

2. 背景条带极多：未做预清除、洗涤次数不足、珠子破碎、IgG 对照选择错误；

3. 填料载量下降：未定期 NaOH 再生、长期高温存放、反复冻融。

十、   售后技术支持

公司：江苏千株松生物科技有限公司

官网：www.qianzhusong.com

技术咨询：17302508337（微信同号）

质保：原装未开封填料 4‑8 ℃储存有效期 12 个月；规范再生条件下填料可重复使用≥20 次。