Capto Q 填料预装柱

样品制备

在将样品应用于色谱柱之前，可以将其离心或通过0.45微米滤膜过滤。无需澄清的样本制备方法

以下的样本制备方法旨在使样本充分均质化，可以直接应用于色谱柱，无需事先澄清。本手册中的方法在我们自己的实验室中已成功使用，但其他已建立的方法也可能有效。

1.         细胞固体的稀释：每克细胞固体加入5-10毫升起始缓冲液。

2.         酶解法：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNA酶，1 mM MgCl2，1 mM PMSF

（最终浓度）。将混合物在室温或4°C下搅拌30分钟，具体温度取决于目标蛋白的敏感性。

3.         机械破碎：在冰上超声约10分钟，用法国压榨机或其他均质器或冷冻/解冻法进行均质，至少重复五次。

机械破碎时间可能需要比标准方案延长，以确保为样品装载提供优化的裂解物（以防止柱子堵塞和背压问题）。不同的蛋白质对细胞破碎的敏感度不同，必须小心避免样品起泡和过热。

4.         调节裂解液的pH值。pH值应至少比目标蛋白的等电点低0.5个单位（阳离子交换填料）或高0.5个单位（阴离子交换剂）。不要使用强酸或强碱进行pH调节（以防止沉淀）。应在制备后立即将未澄清的裂解液直接应用于柱上。

注意：如果未澄清的细胞裂解液在使用前被冷冻，则可能会增加沉淀和聚集的风险。然后，对裂解液进行新的超声处理可以防止在将裂解液装载到柱上时出现增加的背压问题。

选择起始缓冲液和洗脱缓冲液

洗脱缓冲液通常与起始缓冲液具有相同的组成和pH值，但含有更多的盐，通常是氯化  钠。使用阴离子交换剂时，起始缓冲液的pH值应至少比目标分子的等电点高0.5-1 pH单位，使用阳离子交换剂时，起始缓冲液的pH值应至少比目标分子的等电点低0.5-1 pH单位。

缓冲物种和缓冲浓度对于可重复性和稳健的方法至关重要。表3和表4分别列出了阴离 子交换剂和阳离子交换剂的适用缓冲液以及建议的起始浓度。缓冲液浓度应至少为10 mM，只有极少数情况下超过100 mM。

对于未知电荷特性的样品，可以尝试以下方法：

阴离子交换（Q柱和DEAE柱）

起始缓冲液：20 mM Tris-HCl，pH 8.0

洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl，1 M NaCl，pH 8.0

阳离子交换（S柱）

起始缓冲液：50 mM 乙酸钠，pH 5.0

洗脱缓冲液：50 mM 乙酸钠，1 M NaCl，pH 5.0或起始缓冲液：50 mM MES，pH 6.0

洗脱缓冲液：50 mM MES，1 M NaCl，pH 6.0