如何利用Strep-Tactin系统进行蛋白的表达和纯化（一）

Strep-tag系统概述

Strep-tagII是一种短肽(8个氨基酸，WSHPQFEK)，与strep-tactin(一种工程链酶亲和素)具有高选择性结合。Strep-tag II与strep-tactin的结合亲和力(Kd=1µM)比与streptavidin的结合亲和力高近100倍。该技术允许在生理条件下一步纯化几乎任何重组蛋白，从而保持其生物活性。Strep-tag®系统可用于从杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌等任何表达系统中纯化功能性Strep-tag®II蛋白。

Twin-Strep-tag

基于Strep-tag技术，开发了Twin-Strep-tag，其大小为30个氨基酸。

Twin-Strep-tag结合了高特异性和高亲和力的温和条件，因此即使在批量或直接从培养上清液中也能进行高效纯化。

此外，它可以耐受不同的缓冲条件和添加剂(高盐，洗涤剂，还原剂，金属离子和螯合剂)，使其成为不同蛋白质特性的通用标签，特别是蛋白质相互作用分析中的蛋白质复合物。

在Strep-tactin柱上上样并进行短暂洗涤步骤后，通过添加低浓度的脱硫生物素(推荐2.5 mM)对纯化的重组蛋白进行温和洗脱。strep-tacn : Strep-tag II相互作用与多种试剂兼容(见表1)，使该系统对纯化金属和膜蛋白、大蛋白和蛋白质复合物极具吸引力。

结合能力取决于Strep-tactin基质以及融合的重组蛋白。由于其体积小，Strep-tag®II通常不会干扰融合伴侣的生物活性。因此，去除标签就变得多余了。

Strep-tactin蛋白纯化原理

开发Strep-tag原理的基础是众所周知的生物素与链酶亲和素的结合(图1)。为了在蛋白质纯化应用中利用这种强相互作用，我们发现需要有一种肽，当融合到重组蛋白中时，能够与链亲和素的生物素结合口袋结合。这个肽应该作为纯化标签。最终获得的短序列仅包含8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)，并被命名为Strep-tag II。为了优化结合性能，还对streptavidin进行了工程设计，以获得Strep-tactin。

Strep-tag II

Strep-tag II是一个短肽标签(8个氨基酸，WSHPQFEK)，由于其化学平衡的氨基酸组成(WSHPQFEK)，对重组蛋白的影响可以忽略不计。标签可以放置在C端或N端。建议在蛋白质和标签之间使用两个氨基酸间隔(SerAla)，以确保标签的可及性。一般不干扰折叠或生物活性，不与重金属离子缓冲杂质发生反应，不具有离子交换性质，不诱导蛋白质聚集。因此，不需要删除标签。

Twin-Strep-tag

Twin-Strep-tag(WSHPQFEK-GGGSGGGSGG-SAWSHPQFEK)是Strep-tag II的串联版本，具有内部连接区域。这种双版本具有相同的特异性，但对Strep-tactin具有更高的亲和力，即使在批量或直接从培养上清液中也能进行高效纯化。

Strep-tactin蛋白循环纯化程序

Strep-tag II融合蛋白的纯化是简单、直接和友好型的。整个过程可以在接近生理的条件下进行，例如在PBS中。生理缓冲液也可以与多种添加剂联合使用(见表1)。在缓冲液中加入2.5 mM的脱硫生物素。脱硫生物素是一种廉价、可逆结合且稳定的生物素类似物，是链酶亲和素的天然配体，可用于竞争性洗脱Strep-tag II融合蛋白。该系统安全且易于使用，因为净化柱上的颜色变化可以显示柱再生和活性状态。

步骤1+2: 将样品添加到柱子中。一旦标记的蛋白与Strep-Tactin特异性结合，宿主蛋白用少量生理洗涤缓冲液(buffer W)快速洗涤。

步骤3: 然后，结合的Strep-tag II蛋白用含有2.5 mM脱硫生物素(buffer E)的洗涤缓冲液轻轻洗脱，该缓冲液专门与生物素结合口袋竞争。由于洗脱时的缓冲条件基本保持不变，潜在的非特异性结合蛋白(不含Strep-tag II)不会被洗脱，因此不会污染目标蛋白。继Strep-tag II与Strep-tactin特异性结合后，这是该纯化程序的第二个特异性结合步骤，产生极高的蛋白质纯度。

步骤4: 为了使色谱柱再生，加入过量的黄色偶氮染料HABA(2-[4 ' -羟基苯偶氮]苯甲酸)(缓冲液R)以取代结合口袋中的脱硫生物素。一旦HABA结合到结合位点，颜色变为红色，方便地指示柱的再生和活性状态。

步骤5: 只需添加洗涤缓冲液即可去除HABA。一旦红色消失，柱子就可以重复使用。Strep-Tactin树脂可以再生和重复使用3至5次而不会损失性能。