如何利用Strep-Tactin系统进行蛋白的表达和纯化（二）

蛋白表达

异源蛋白的产生通常伴随着大肠杆菌细胞的生长受损。因此，异源生物合成的调控通常推荐使用启动子，其活性可被抑制子阻断。如果外源蛋白具有细胞毒性，即使少量的外源蛋白产生，也会导致对含有表达质粒的大肠杆菌细胞的剧烈选择。在这种情况下，需要严格抑制启动子。然后通过添加化学诱导剂，以可控的方式开启基因产物的合成。携带tetA耐药基因启动子/操作子区域的Strep-tag II表达载体pASK-IBA/pASG-IBA是这种诱导表达系统的最先进解决方案。tetA启动子的强度与lac-UV5启动子相当(接近T7启动子活性的25%)。

可以通过添加无水四环素(200 ng/ml)完全诱导，但浓度不具有抗生素效果。tet抑制基因的组成表达，也编码在表达质粒上，保证在没有诱导剂的情况下抑制启动子。在Western blot中，在这些条件下没有检测到任何表达。lac启动子易受分解代谢物抑制(cAmp水平、代谢状态)和染色体编码抑制分子的影响，而tetA启动子/操作子不与任何细胞调节机制耦合。因此，在使用tet系统时，在培养基和大肠杆菌表达菌株的选择上基本没有限制。例如，葡萄糖最低培养基，甚至细菌菌株XL1-Blue，携带四环素耐药基因的外体拷贝，都可以用于表达。

→周质分泌推荐JM83或W3110。

实验方案

菌落不应超过1周。我们建议使用过夜菌落。不要从甘油储备中接种。

在大多数情况下，将培养前的生长温度降低到22°C - 30°C可以大幅提高可溶性功能蛋白的产量。在接种生产培养物之前，注意细胞不要长时间处于静止状态。

2. 表达培养:用含100µg/ml氨苄西林(或30µg/ml氯霉素，视质粒而定)的100 ml LB培养基接种预培养，37℃摇匀。

3.监测光密度在550 nm (OD550)。OD550 > 1.0的细胞悬液样品应在测量前用LB培养基稀释。

在进行SDS-PAGE检测之前，整个样本应在超声浴中孵育15分钟，将染色体DNA剪切成小块，并应加热到70°C 10分钟。

5. 当OD550为0.5 ~ 0.6时，加入10µl无水四环素原液。通过将生长温度降低到22-30℃，可显著提高可溶性功能蛋白的产量，特别是目标蛋白在周质表达的情况下。

6. 以200转/分的速度摇3小时。在某些情况下，过夜诱导可增加蛋白质产量。

继续进行澄清的裂解物的制备或在-20℃保存细胞颗粒。

细菌表达具有在短时间内低成本获得表达产物的优点。然而，有些蛋白质不能在大肠杆菌中表达。在这种情况下，酵母、昆虫、哺乳动物或植物细胞可以作为替代表达宿主。IBA的StarGate克隆系统为这些宿主(酵母，哺乳动物和昆虫细胞(pYSG-， pESG-， pCSG-和pLSG-IBA载体))提供多种亲和性标签(Strep-tag II, Twin-Strep-tag，6x histidin-tag, FLAG-tag和GST-tag)的表达载体。

预防生物素导致Strep-Tactin蛋白失活的注意事项

游离生物素几乎不可逆地结合到Strep-Tactin。因此，它阻止了Strep-tag II融合蛋白的结合，而且，使Strep-Tactin树脂（千株松，QS01015)失活。因此，在亲和层析之前必须去除或掩盖。最好和最简单的预防措施是在色谱之前添加化学计量量的链霉亲和素，以进行不可逆的掩蔽。其他解决方案是通过透析去除，硫酸铵沉淀或交叉流过滤/浓缩。

当含有分泌型重组蛋白的细胞培养上清直接进行Strep-Tactin亲和层析时，生物素问题最相关，因为真核培养基(用于哺乳动物或昆虫细胞表达以及酵母)可能含有大量生物素。

生物素化蛋白和游离生物素的细胞内部含量相当低，对链球菌肌动蛋白树脂的显著失活没有威胁(生物素容量≥350 nmol/ml沉积树脂和细胞内部生物素含量极低，例如大肠杆菌中为7 nmol/l/OD)。

关于表达的常见问题处理