一、说明

DYKDDDDK或FLAG®标签是一种可以通过重组DNA技术添加到蛋白质中的八肽标签。它可以与目的蛋白的N-末端或C-末端融合，便于检测和纯化。千株松 Anti‐Flag Affinity Resin 4FF（QS01016）用于从常用的蛋白表达系统(包括细菌、酵母和哺乳动物细胞)中纯化含DYKDDDDK标签的蛋白。细胞裂解液中含DYKDDDDK标签的蛋白可以特异性地与偶联到填料上的抗DYKDDDDK标签的单克隆抗体结合。通过严格的洗涤步骤消除非特异性结合的杂蛋白，最终以高回收率洗脱目标蛋白。表1列出了Anti‐Flag  Affinity Resin 4FF的主要特征。

表 1. Anti‐DYKDDDDK  Affinity Resin 4FF的特征

基质                                    4% 交联琼脂糖

平均粒径                            90 μm

配基                                    小鼠抗DYKDDDDK标签单克隆抗体，单克隆G1

结合能力                            大约1mg DYKDDDDK标签蛋白/1 ml沉淀填料

储存条件和稳定性            在2-8°C下可保存12个月。不要冷冻填料。

填料重复使用                    可循环使用至少4次。维护得当，可以重复使用10次，结合力几乎没有损失。

洗脱方法                            酸性、碱性、中性、多肽竞争或SDS–PAGE上样缓冲溶液洗脱*

试剂的兼容性                    与一定浓度的常用试剂相容

*如果用SDS-PAGE上样缓冲溶液洗脱，G1抗体重链变性并从填料中释放。

二、 纯化需要的设备和试剂（本产品不提供）

l  蒸馏水

l  微量移液器

l  微量离心管

l  涡旋混合器

l  加样槽

l  空柱子

l  血清移液管(5 ml, 10 ml)

l  细胞裂解缓冲溶液

l  蛋白酶抑制剂试剂

l  缓冲溶液(表2列出了使用Anti‐Flag  Affinity Resin所需的缓冲溶液)

 表2. 使用Anti‐Flag  Affinity Resin 4FF所需的缓冲溶液

三、使用说明

         1.      样品制备

为了获得最佳结果，请遵循以下样品制备建议。

1)根据蛋白特性制备样品，优化裂解条件，最大限度地减少干扰目标蛋白结合的因素(见试剂相容性表)。

2)对于DYKDDDDK标签蛋白的结合步骤，在中性pH下选用适当的盐(NaCl)浓度缓冲溶液溶解样品。

3)样品不应含有不溶性颗粒。在进行上样结合步骤前，先过滤样品或在4°C下高速离心10‐15分钟，以去除不溶性物质

4)为了防止纯化过程中蛋白质的降解，可以在细胞裂解过程中冰制样品和/或在样品中加入蛋白酶抑制剂。

   5)细胞裂解时，加入内切酶，降低因染色体DNA或RNA释放引起的样品粘度。

   6)避免频繁的冻融循环。将裂解液/样品分成等份，并在‐80°C下存储。

2.      准备填料

1)将一根空柱子放在一个坚固的支撑物上;用TBS冲洗柱子一次。

2)用轻柔的反转方法彻底重悬填料，并立即将适量的浆液装入柱子内。为了方便填料浆液转移，建议使用宽口径吸管头。

3)用3倍柱体积的TBS洗涤平衡填料，共重复3次。让缓冲溶液通过重力从柱子中流出;不要让填料变干。

3.      结合步骤

Anti‐DYKDDDDK Affinity Resin 4FF可以通过柱色谱、批次结合或免疫沉淀(IP)等不同方法纯化DYKDDDDK标签蛋白。如果样品体积在50ml左右，且DYKDDDDK标签蛋白的含量小于4mg，则建议采用2‐4ml沉淀填料的柱结合方式。对于更大的样本量，批量结合方式是推荐的快速和高效的纯化方法。对于小体积低蛋白表达的样本，采用免疫共沉淀的方法(见第III.7节DYKDDDDK标记蛋白的免疫共沉淀)

3.1 柱层析法

1)将制备好的样品在室温重力流速下加载到柱子上。在柱子的底部安装一个缓冲溶液储存器以便接收大量的液体。多次收集和重新加载样品流穿液以获得最大的结合载量。较低的流速可以促进更好的目标蛋白与填料结合。

2)用10-20柱体积的TBS清洗柱子，以减少非特异性结合。

3)让色谱柱完全排干，进入洗脱程序。(见第III.4节DYKDDDDK标记蛋白的洗脱)

3.2 批次结合

1)将柱子中准备好的填料(如第III.2节所述)与含有目的蛋白的制备样品充分混合重悬。

2) 将重悬的树脂转移到剩余的样品溶液里。室温下样品与Anti‐DYKDDDDK Affinity Resin 4FF旋转孵育至少30分钟。

3)孵育后，将样品与填料装入另一个柱子上收集填料。保存样品的流穿液，以供进一步使用。

4)用10 ~ 20倍体积的TBS清洗填料，以去除任何非特异性的结合杂质。

5)让色谱柱完全排干，进入洗脱程序。(见第III.4节DYKDDDDK标记蛋白的洗脱)

备注:

1.通过经验可以延长结合时间。孵育可以在4°C下进行过夜，并进行首尾相连的旋转。为防止蛋白质降解，应在样品中加入蛋白酶抑制剂。

2.通过SDS – PAGE 分析 或 Western Blot 检测， 确定 DYKDDDDK 标签蛋白的结合效率。

4.    DYKDDDDK标记蛋白的洗脱

根据蛋白质特性和下游应用推荐五种洗脱方法。所选择的洗脱方法应保持蛋白质结构的完整性和生物学功能，并与下游应用兼容。多种洗脱方法可联合使用，以达到最佳效果。所有方法均可在室温下进行;根据特殊要求，可能需要降低温度。在最后的清洗步骤后，立即将洗脱缓冲溶液装入柱上。关于推荐的洗脱缓冲溶液的配方，请参阅第二节，需要但不提供的设备和试剂。

4.1 用pH 12.0的碱性洗脱缓冲溶液洗脱

用6个柱体积的碱性洗脱缓冲溶液(pH 12.0)洗脱结合的DYKDDDDK标记的蛋白，洗脱液进入包含1/20柱床体积1M HCl的小瓶中以便中和pH值。以1ml沉淀填料为例，用6×1ml洗脱缓冲溶液依次洗脱，分别用6小瓶(含50 μl 1M HCl)收集洗脱液。不要将柱子放在碱性洗脱缓冲溶液中超过15分钟;洗脱后立即重新平衡色谱柱。(参见III.5的一节)

4.2 用pH 10.5的碱性洗脱缓冲溶液洗脱

该缓冲溶液的pH值(10.5)低于碱性洗脱缓冲溶液(pH 12)，有助于保持靶蛋白的生物活性。在某些情况下，这一过程可能不能像碱性洗脱缓冲溶液(pH 12.0)那样回收较多的DYKDDDDK标签蛋白。用6倍柱床体积的碱性洗脱缓冲溶液(pH 10.5)将结合的目标蛋白洗脱到包含1/40床体积1M HCl的小瓶中。不要将柱放在碱性洗脱缓冲溶液中超过15分钟;洗脱后立即重新平衡色谱柱。(见第III .5节重新平衡)

4.3 用0.1 M酸洗脱缓冲溶液洗脱

用6个柱床体积的酸性洗脱缓冲溶液(pH 3.5)洗脱结合的目标蛋白，进入包含1/20床体积1 M Tris的小瓶，pH 9.0。色谱柱在酸性洗脱缓冲溶液中停留时间不要超过15分钟;洗脱后立即重新平衡色谱柱。

4.4 用竞争洗脱缓冲溶液洗脱

与添加的DYKDDDDK或FLAG®肽竞争性结合可以洗脱结合的靶蛋白。竞争性洗脱缓冲溶液中DYKDDDDK或FLAG®肽的浓度在100‐500µg/ml之间。通过重力流速将2‐3柱床体积的竞争性洗脱缓冲溶液装入柱中;在填料上方留有约1倍柱床体积的洗脱缓冲溶液时，封住柱子底部液体出口，在室温下孵育30‐60分钟;打开色谱柱的末端，收集洗脱液。

4.5 中性洗脱缓冲溶液洗脱

高浓度的NaCl可以洗脱DYKDDDDK标记蛋白。依次将5x1床体积的3M NaCl缓冲溶液(pH 7.4)加载到柱上，收集洗脱液。当3M NaCl不能完全洗脱靶蛋白时，NaCl浓度可提高到4M。

5.    重新再平衡

洗脱后，用TBS缓冲溶液清洗填料，去除残留的洗脱缓冲溶液，可能使固定在填料上的G1抗体变性。建议每次用5-10倍柱床体积的TBS缓冲溶液清洗填料3次。在最后一次洗涤后，让TBS缓冲溶液完全排干，然后在填料中加入2倍柱床体积的TBS以备下次使用。

6.    Anti‐DYKDDDDK Affinity Resin 4FF的再生

Anti‐DYKDDDDK Affinity Resin可以重复使用多次来纯化相同的蛋白而不需要再生。如果要纯化的目标DYKDDDDK标签蛋白不同，则必须使用以下方案再生填料:

6.1 用0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0的2倍柱床体积洗涤填料。

6.2 用0.1 M醋酸钠，0.5 M NaCl, pH 4.0的2倍柱床体积洗涤填料。

6.3 用3‐5倍柱床体积的TBS重新平衡填料。

6.4 为了长期储存，填料应储存在含有0.02%叠氮化钠的TBS中，温度为2-8℃。

7.    DYKDDDDK标签蛋白的免疫沉淀

对于从少量起始样品(例如1-2毫升细胞裂解液)中纯化的目的蛋白，可以应用免疫沉淀程序。

7.1 重悬填料形成均匀的浆液，将40‐100 μl浆液转移到1.5 ml小瓶中。

备注: 建议使用大口径吸液头转移填料浆液。

7.2 在小瓶中加入500 μl TBS，轻轻混合填料。6000×g离心30秒，小心吸走上清液，重复这个步骤两次。每次清洗后，小心地尽可能多地吸走上清液，而不要干扰沉淀的填料。

7.3 向洗涤后的填料中加入样品。如样品体积小于1ml，加入裂解缓冲溶液或TBS使样品总体积为1ml。

7.4 在室温条件下，用管式旋转器首尾相连旋转混合至少1小时。

备注:为了达到最佳的洗脱效果，可延长孵育时间，也可降低孵育温度。

7.5离心6,000×g 30秒。仔细清除上清液，加入TBS清洗填料三次。在不干扰填料的情况下尽可能多地清除上清液，进入洗脱程序。

7.6极端pH条件或DYKDDDD八肽可以洗脱DYKDDDDK标签蛋白。与目的蛋白结合的填料也可以直接用于SDS-PAGE分析。根据目的蛋白的特性及下游应用选择以下两种洗脱方法之一。

1)用pH 12.0的碱性洗脱缓冲溶液洗脱

将120‐300 μl(3个柱体积)的碱性洗脱缓冲溶液加入到清洗后的填料中，使用一个宽孔吸液管头轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。培养后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个含有5‐15 μl 1m HCl的新瓶中以供进一步使用。

2)用酸洗脱缓冲溶液洗脱

在清洗后的填料中加入120‐300 μl(3个柱体积)的酸洗脱缓冲溶液，使用一个宽孔吸液管尖端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。培养后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到含有5‐15 μl 1m Tris, pH为9.0的新瓶中继续使用。

3)用竞争洗脱缓冲溶液洗脱

将120‐300 μl(3个柱体积)的100 μg/ml DYKDDDDK八肽洗脱缓冲溶液加入到洗涤后的填料中，使用宽孔吸液管顶端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。培养后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个新的小瓶中以便进一步使用。

4)中性洗脱缓冲溶液洗脱

向洗涤后的填料中加入120‐300 μl(3柱体积)3M NaCl, pH 7.4，使用一个宽孔吸液器尖端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。培养后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个新的小瓶中以便进一步使用。

5) PAGE凝胶样品缓冲溶液洗脱

为了尽量减少填料固定化的G1抗体的变性和洗脱，样品缓冲溶液中不应包含还原试剂(β-巯基乙醇或DTT)。还原试剂将分解G1抗体的重链和轻链。如果还原条件绝对必要，可以加入还原剂。试剂相容性见表3。

在洗涤后的填料中加入40‐100 μl(1柱体积)的PAGE凝胶样品缓冲溶液，混匀。煮沸3分钟，8000 × g离心30秒。小心地将上清液倒入一个新的小瓶中。

四、试剂兼容性表

所列试剂的耐受浓度是通过在指示浓度下添加所列试剂来检测的。

五、问题处理

六、相关产品