01/产品概述
QS01004 以高度交联的 6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联羧甲基乙二胺(TED)为配体，螯合镍离子后，形成非常稳定的八面体结构。与IDA、NTA 等其它类型 Ni 填料相比，QS01004 具有更强的兼容性，在常用的试剂中 Ni 离子的脱落率极低，对 EDTA、DTT、NaOH、HCl 等具有很强的耐受性，可以直接用NaOH 溶液对填料进行清洗而无需反复再生。该产品可以用于大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对His - tag 蛋白的纯化。
组分 | QS01004 - 01 | QS01004 - 02 | QS01004 - 03 | QS01004 - 04 |
QS01004 | 25ml | 100ml | 500ml | 1L |
03/保存条件
4 ~ 30℃保存，常温运输。
04/适用范围
适用于捕获和纯化各种样品中His-tag 蛋白，包括大肠杆菌表达的可溶性蛋白或包涵体，真核细胞培养上清液等。
05/自备材料
可使用下列推荐缓冲液，洗脱原理为低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH 上样，低 pH 洗脱。缓冲液在使用前最好用
0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌，避免堵塞仪器或填料。
1. 可溶性 His-tag 蛋白纯化：
a. 结合缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，pH 8.0
b. 洗杂缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8.0
c. 洗脱缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 8.0
2. 包涵体 His-tag 蛋白变性条件下纯化：
a. 结合缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，8 M Urea，pH 8.0
b. 洗杂缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，8 M Urea，20 mM 咪唑，pH 8.0
c. 洗脱缓冲液：20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，8 M Urea，500 mM 咪唑，pH 8.0
注：
(1) 为了提高目的蛋白的洗脱纯度，建议在洗杂液中加入低浓度的咪唑(建议浓度：10 - 40 mM 咪唑，具体浓度可根据不同蛋白进行优化)，或根据不同蛋白调整洗脱液中咪唑的浓度，以达到最佳的洗脱效果。
(2) 为了降低离子作用蛋白的吸附，可以在平衡液中加入 0.5 - 1 M 的 NaCl。
(3) 可以采用低pH 洗脱或与咪唑洗脱相结合，如 pH 2.5 - 5。
(4) 缓冲液除了磷酸盐缓冲液，还可使用 Tris 缓冲液、甘氨酸缓冲液等。
05-2 /样品准备：
a. 原核表达结束后，将培养液转移至离心管，离心收集菌体，按照菌体 : 结合缓冲液=1 : 10(w/v)的比例进行破碎(为防止
蛋白降解可加入终浓度为 1 mM 的 PMSF 或其他蛋白酶抑制剂；若菌体黏度较高，可适当加入 10 μg/ml RNase A 和 5 μg/ml DNase I 降解核酸，降低黏度)。
b. 将菌体重悬后混匀，通过超声破碎或高压破碎释放蛋白。
c. 将破碎后的菌液转移至离心管中，10,000 rpm(16,744 × g)，4℃离心 20 - 30 min，取上清，用 0.22 μm 或者 0.45 μm
滤膜过滤，置于冰上备用。
a. 原核表达结束后，将培养液转移到离心管中，离心收集菌体，按照菌体 : 结合缓冲液(不含 8M 尿素)=1 : 10(w/v)的比例进行重悬。
b. 将菌体重悬后混匀，通过超声破碎或高压破碎。
c. 将破碎后的菌液转移至离心管中，10,000 rpm(16,744 × g)，4℃离心 20 - 30 min，弃上清。 d.按照菌体 : 结合缓冲液(含 8M 尿素)=1 : 10 或 1 : 20 比例重悬包涵体，反复吹打，直至溶解。
e.溶解后的包涵体转移至离心管中，10,000 rpm(16,744 × g)，4℃离心 20 - 30 min，取上清，用 0.22 μm 或者 0.45 μm
滤膜过滤，置于冰上备用。
a. 将细胞培养液转移至离心管中，7,000 rpm(11,720 × g)，4℃离心 15 min，取上清。 b.用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤。
c.样品中含有可耐受范围内试剂可不用进行透析或脱盐，可直接上样。
06/注意事项
本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
07/实验原理与流程概要
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Fig1.QS01004 纯化His-tag 蛋白原理与流程概要
08/实验流程
1. ddH2O 冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1 - 2 cm ddH2O。
2. 将填料混匀，小心地将浆液连续地倒入层析柱中，用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3. 如果使用填充式储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样适配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4. 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，避免液压对形成的柱床造成冲击，也可以避免柱床形成不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用泵的最大流速，以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱体积的ddH2O。标上柱床高度。 (在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的 75%)。
5. 关闭泵，关闭层析柱出口。
6. 如使用储液器，断开储液器连接，将适配器安装到层析柱上。
7. 在适配器入口断开的情况下，将适配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许填料溶液冲洗适配器入口，锁紧适配器接头。
8. 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如有必要可重新调整适配器。
08-2 /样品纯化
装柱后，可用各种常规的中低压色谱系统，以 1ml 规格在ÄKTA 使用下为例进行说明
1. 连接：将泵管道注满ddH2O，去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2. 水洗：用 5 - 10 倍柱体积ddH2O 以 1 - 2 ml/min 流速清洗填料。
3. 平衡：用 5 - 10 倍柱体积结合缓冲液以 1 - 2 ml/min 流速平衡填料，保证填料中的溶液组分、pH 与样本一致。
4. 进样：低流速进行上样，建议流速为 1 ml/min(样品的上样量不要超过柱子的最大结合能力，防止过载或超压；蛋白的结合能力随着裂解物的类型、目标蛋白的性质、流速、pH 变化而变化，流速越低，结合效率越好)，收集流穿液。
5. 二次平衡：用 5 - 10 倍柱体积结合缓冲液以 1 ml/min 流速平衡填料，保证样本与填料的结合处于稳定状态。
6 洗杂：用 10 - 20 倍柱体积洗杂缓冲液以 1 ml/min 流速进行洗杂，清洗非特异性吸附的杂蛋白，并收集洗杂液用于后续分析。
7. 洗脱：
a. 一步法洗脱：用 5 倍柱体积洗脱缓冲液以 1 ml/min 流速进行洗脱，并收集洗脱液用于后续分析。
b. 线性洗脱：线性洗脱梯度(10 - 20 柱体积)以 1 ml/min 流速进行洗脱并收集洗脱液用于后续分析(线性洗脱可获得更高纯度的蛋白，但是洗脱液中的目标蛋白浓度较低)。
8. 水洗：建议用更高浓度咪唑(如 500 mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用 5 倍柱体积的结合缓冲液和 5
倍柱体积的ddH2O 以 1 ml/min 流速清洗填料。
9. 保存：用 5 - 10 倍柱体积 20%乙醇以 1 - 2 ml/min 流速清洗填料，4 ~ 30℃长期保存。
08-3 /SDS - PAGE 检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出液、洗杂液及洗脱液等组分)利用SDS - PAGE 进行检测，判定其纯化效果。
08-4 /在位清洗
| 需要去除的污染物操作离子作用结合的蛋白1. 使用 5 倍柱体积的 1.5 M NaCl 溶液清洗 10 - 15 min；2.使用 10 倍柱体积的ddH2O 或结合缓冲液清洗沉淀蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白1. 使用 1 M 的 NaOH 溶液清洗 1 - 2 h(如果是去除内毒素，则需要更长的时间)；2. 使用 10 倍柱体积的ddH2O 或结合缓冲液清洗疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类1.使用 30%异丙醇(5 - 10 倍柱体积)，清洗 15 - 20 min；2.使用 10 倍柱体积的 ddH2O 或结合缓冲液清洗或者使用含有 0.1 - 0.5%非离子去污剂的 0.1 M 醋酸溶液，清洗 1 - 2 h；3.使用 5 倍柱体积的 70%乙醇，以去除多余的去污剂；4.使用10 倍柱体积的ddH2O 或结合缓冲液清洗 |
正常情况下，QS01004 是无需重新挂镍再生的。在使用过程中，如果发现反压过高或者填料表面出现明显的污染物时，需要对其进行在位清洗操作(CIP)。建议按照以下操作去除填料上残留的污染物。
09/实验案例
a.层析柱：QS01004、竞品 Supplier A b.样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白 c.流速：1 ml/min
2.
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上图为 QS01004 和竞品 Supplier A 纯化原核来源蛋白的层析图谱，从图中可以看出，QS01004 洗脱峰值显著高于竞品。 SDS - PAGE 电泳检测纯化过程中的各组分，可以看出两种层析柱均能够通过线性洗脱得到纯度>95%的目的蛋白。经过浓度检测，竞品Supplier A 洗脱得到 10.7 mg 目标蛋白，QS01004 洗脱得到 12.6 mg 目标蛋白。QS01004 载量优于竞品。
09-2 /兼容性测试分析(真核来源蛋白以及 100 kDa 蛋白)
1.纯化方案
a.层析柱：QS01004、竞品 Supplier A b.样品：
哺乳动物细胞上清、酵母细胞上清、100 kDa 大分子蛋白
c.流速：1 ml/min 2.纯化结果分析
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以竞品 Supplier A 作为对照，QS01004 可以兼容不同类型的表达系统以及大分子蛋白的纯化，纯化效果≥竞品Supplier A，表明QS01004 有着较好的样品兼容性。
09-3 /NaOH 处理 48 h
1.纯化方案
a.层析柱：QS01004(1 M NaOH 冲洗 48 h)、QS01004(未处理) b.样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白
c.流速：1 ml/min 2.纯化结果分析
图a 为QS01004 经 1 M NaOH 处理 48 h 和未处理的纯化层析图谱，从图中可以看出处理前后的层析柱纯化图谱无显著差异。
图b 为SDS-PAGE 电泳检测纯化过程中的各组分结果，可以看出 1 M NaOH 处理后对纯化功能未有明显影响，流穿液中未检出目的条带，通过一步洗脱得到纯度>95%的目的蛋白，回收率相当。综上，QS01004 能够长时间耐受较高浓度的 NaOH，且性能不受影响。
09-4 /耐受 DTT 测试
1. 纯化方案
a. 层析柱：QS01004
b. 样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白(分别添加 0 mM、5 mM、10 mM DTT) c.流速：1 ml/min
2. 纯化结果分析
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对图谱和SDS - PAGE 结果进行分析，QS01004 在 5 mM、10 mM DTT 作用下，目的蛋白的纯度和回收率无显著变化，与竞品相当。综合比较，QS01004 耐受 10 mM DTT，且性能不受影响。
09-5 /耐受 EDTA 测试
1. 纯化方案
a. 层析柱：QS01004
b. 样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白(分别添加 0 mM、5 mM、10 mM EDTA) c.流速：1 ml/min
2. 纯化结果分析
对图谱和SDS-PAGE 结果进行分析，QS01004 在 5 mM、10 mM EDTA 作用下，目的蛋白的纯度和回收率无显著变化，与竞品相当。综合比较，QS01004 耐受 10 mM EDTA，且性能不受影响。
09-6 /不同浓度的咪唑对洗脱效果的影响
1. 纯化方案
a. 层析柱：QS01004
b. 样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白 c.流速：1 ml/min
2.
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纯化结果分析
咪唑可以与 His-tag 蛋白竞争结合 Ni2+，低浓度的咪唑可以降低非特异性结合杂蛋白。从图 a 中可以看出，洗杂缓冲液中咪唑浓度从 20 mM 提高至 30 mM 后层析图谱保持较好的一致性，未有显著变化，但是对不同咪唑浓度洗脱下的组分进行 SDS - PAGE 分析显示(图 b)，将洗杂咪唑浓度提高至 30 mM 后洗脱组分中的杂带有明显的减少，且洗脱的目的蛋白产量保持较好的一致性。因此，适量的咪唑可以有效提高目的蛋白的纯度和回收率。
09-7 /包涵体 His-tag 蛋白变性条件下纯化
1. 纯化方案
a. 层析柱：QS01004
b. 样品：大肠杆菌表达的包涵体蛋白 c.流速：1 ml/min
2. 纯化结果分析
从图谱和SDS-PAGE 结果可以看出，QS01004 在 8M Urea 变性条件下依旧可以对 His-tag 蛋白进行纯化，且纯度较高。
09-8 /可重复使用性测试
1. 纯化方案
为了测试QS01004 的可重复使用性，在同一柱上进行了连续 20 次的运行。
a. 层析柱：QS01004
b. 样品：大肠杆菌表达的可溶性蛋白 c.流速：1 ml/min
2. 纯化结果分析
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为了测试 QS01004 的可重复使用性，在同一柱上连续进行了 20 次运行。图 a 为前 14 次运行的洗脱样品 SDS - PAGE胶图，表现出非常好的重复性；图b 为 16-20 次运行的洗杂和洗脱样品的 SDS - PAGE 胶图，洗杂步骤的去杂效果未见明显下降，洗杂和洗脱效果表明QS01004 具有较好的重复性。
附录一、 QS01004 产品参数
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项目 参数
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基质 6%琼脂糖
载量 ＞30 mg/ml
粒径 45 - 165 µm
粒度，d50 V2 ~ 90 μm
推荐流速 150 - 300 cm/h
耐受压力 0.3 MPa
pH 值稳定性 （CIP） 2 - 14
pH 值稳定性（操作） 3 - 12
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储存 20%乙醇
附录二、QS01004 化学耐受性
试剂种类 耐受时间
0.01 M HCl 和 0.01 M NaOH 1 week
10 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)、5 mM DTT、1 M NaOH、5 mM TCEP、20 mM β-巯基乙醇和 6 M 盐酸胍
24 h
500 mM 咪唑和 100 mM 乙二胺四乙酸(EDTA) 2 h
30%异丙醇 20 min
问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
层析柱进气 |
接柱过程中引入气体或在使用过程中缓冲液走空 | 接柱过程中注意排除引入的气泡；使用过程中避免缓冲液走空。 如果进入气泡，可用合适的高流速冲洗排气。 |
柱子压力过高 |
填料堵塞 | 细胞分泌上清或裂解液有微量固体颗粒，建议在上样前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤，或通过离心去除。适当加大离心转速、延长离心时间，去除效果更好。 |
样品黏稠 | 细胞裂解物中的核酸物质会导致样品黏稠，可添加适量核酸酶消化核酸，降低黏度。 | |
洗脱组分中没有目的蛋白 |
目的蛋白流穿 | 1.可能是由于His 标签没有充分暴露，可在蛋白中加入适量的尿素或盐酸胍等变性剂，或者考虑更换标签位置；2.适当提高缓冲液 pH、降低咪唑浓度、调整缓冲液中盐离子浓度或者更换缓冲液都可能会提高 His 标 签蛋白的挂柱能力 |
表达量太低 | 表达量过低，富集的蛋白太少未能检测到，可优化表达条件，提高表达量。 | |
目的蛋白在洗杂阶段洗出 | 目的蛋白结合较弱，可降低洗杂液中咪唑浓度或提高洗杂液的 pH。 | |
目的蛋白结合过强，不易洗脱 | 增加洗脱液中的咪唑浓度，或降低洗脱液的pH。 | |
蛋白易降解 | 在样品中添加适量的蛋白酶抑制剂，如 1 mM PMSF | |
洗脱组分中蛋白杂带较多 | 洗杂不彻底 | 增加洗杂液的洗脱体积，或提高洗杂液中的咪唑浓度 |
样品中含有其他的组氨酸标 签蛋白 | 可优化咪唑洗脱浓度或调节 pH 洗去杂带。使用离子交 换层析或分子筛等纯化手段进一步纯化蛋白。 | |
上样过程中蛋白发生浑浊或沉淀 | 操作温度太低 | 蛋白不失活的情况下可室温进样 |
蛋白稳定性差 | 探究蛋白的 pH、温度、盐浓度稳定性，选择合适的缓冲液 | |
蛋白发生聚集 | 样品和缓冲液中可添加表面活性剂稳定蛋白，如 0.1% 的Triton X - 100 或Tween - 20。 |
0511-80277669
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