澄清裂解物的制备
胞质表达Strep-tag®II融合蛋白后制备澄清裂解物
方案
1、在4°C环境下，冷却缓冲液W（千株松，QS05038）。
2、将100 mL培养物的颗粒重新悬浮于1 mL缓冲液W中。
3、取10µL样品，采用SDSPAGE和(或)Western blot法检测总蛋白含量。10µL样品应与90µL缓冲液W和25µL 5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（千株松，QS05028)充分混合。储存于-20°C。整个样本必须在超声浴中孵育15分钟以便将染色体DNA剪切成小片段，并在SDS-PAGE检测前加热到70℃并持续10分钟。
4、在冰浴冷却下对残余悬浮液进行超声处理。注意悬浮液不要让其升温甚至变热，否则可能使蛋白质变性或激活蛋白酶。裂解应完全并可通过在590 nm测量光密度来监测[%裂解率= (1-A590超声处理/ A590悬浮液)× 100]。
5、(可选)若裂解物粘稠，则加入RNase A(10µg/ml)和DNase I(5µg/ml)在冰上孵育10 - 15分钟。
6、在4℃下以13000 rpm将悬浮液离心15分钟。
7、不溶性细胞成分沉淀。如果重组蛋白形成包涵体，它将存在于沉积物中。
8、小心地将上清液转移到干净的试管中。对于表达蛋白的不溶性部分，用1.25 mL 1x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液溶解沉淀(= 250µl 5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液与1 mL缓冲液W混合)。将上清液储存在中冰水中直到开始层析实验，如果当天无法进行层析实验，则储存在-20℃。
9、继续在自然条件下进行Strep-tag蛋白纯化的方案。
Strep-tag II/Strep-Tactin 亲和纯化不应以批处理模式不连续地进行，这将导致与柱层析相比蛋白质纯度和产量显著降低。此外，延长的批次孵育会增加目标蛋白的蛋白水解降解(包括标签裂解)的风险。
周质表达Strep-tag II融合蛋白后制备澄清裂解物
周质蛋白分泌到位于大肠杆菌外膜和内膜之间的周质间隙。只有当重组蛋白具有被大肠杆菌前导肽酶易位后裂解的N末端信号肽(如OmpA)时，才有可能产生适当的分泌。为了使用Strep-Tactin技术纯化分泌到周质间隙的蛋白，可以使用pASKIBA2, 2C, 4, 4C, 6, 6C, 12, 14, 44和pASG-IBA2, 4, 44, 102, 104, 142, 144将Strep-tag II融合到C端或N端。
方案
0511-80277669
客服1 
客服2