巯基偶联填料（QS01043）

一、 产品描述

Iodoacetyl Agarose Beads 4FF是一类预活化树脂，其纯化原理在于可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化，进而利用抗原抗体的特异性反应对免疫血清中的抗体进行高效纯化，是多克隆抗体生产中不可缺少的纯化介质。

表1  Iodoacetyl Agarose Beads 4FF产品性质

二、偶联方法

针对巯基和氨基的偶联条件有所差异，请分别进行选择。

1 含巯基抗原的偶联流程

1.1缓冲液准备

所用水和 Buffer 在使用之前建议用0.22 μm或0.45μm滤膜过滤。

偶联液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5

封闭液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保护液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

结合/洗杂液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脱液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

1.2抗原准备

使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为 1-3 mg/mL的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。

注：① 抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂 TCEP，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超过12 mg，具体使用量需要自行优化。

② 如果使用 DTT 等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。

1.3抗原偶联

1）取适量Iodoacetyl Agarose Beads 4FF，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作 2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。

2）关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30 min。

注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。

3）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出液。

注：如有需要，可以使用 Ellman’s Reagent 检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。

4）关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，于28℃震荡孵育30 min。

5）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。

注：如果立即使用，可以参考【抗体纯化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于 4℃冰箱保存。

1.4抗体纯化

1）将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。

2）将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 mL/min，并收集流出液。

3）用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。

4）使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。

注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。

2 含氨基抗原偶联流程

2.1缓冲液准备

所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤。

偶联液：0.1 M NaHCO3，0.5 M NaCl，pH 8.5

封闭液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保护液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

结合/洗杂液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脱液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2.2抗原偶联

1）使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5-10 mg/mL的抗原溶液。

2）取适量SulfoLink Coupling Agarose Resin，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。

3）关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于 28℃震荡孵育3-5 h，或者4℃震荡孵育过夜（12-15 h）。

注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。

4）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，待测试。

5）关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30 min。

6）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。

注：如果暂不使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于4℃保存。

2.3抗体纯化

1）将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。

2） 将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在 0.5-1 mL/min，并收集流出液。

3）用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。

4）使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。

注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。

三、SDS-PAGE 检测

将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE（千株松，QS05046）检测纯化效果。

四、问题与解决方案

五、相关产品