Western Blot技术历史（四）

二维电泳

   二维SDS-PAGE使用上述原则和技术。2-D SDS-PAGE顾名思义，涉及多肽在二维上的迁移。例如，在第一维中，多肽按等电点分离，而在第二维中，多肽按分子量分离。给定蛋白质的等电点是由带正电的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸)和带负电的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸)的相对数量决定的，带负电的氨基酸形成低等电点，带正电的氨基酸形成高等电点。样品也可以首先在非还原条件下使用SDS-PAGE分离，然后在第二次元的还原条件下分离，这将破坏将亚基结合在一起的二硫键。SDS-PAGE也可以与urea-PAGE偶联用于二维凝胶。

   原则上，这种方法允许在单个大凝胶上分离所有细胞蛋白。这种方法的一个主要优点是，它通常可以区分特定蛋白质的不同同种异构体，例如，已经磷酸化的蛋白质(通过添加带负电荷的基团)。分离出来的蛋白质可以从凝胶中分离出来，然后用质谱法分析，从而确 定它们的分子量。

Western Blot相关问题

检测问题

   由于与所用抗体和抗原的数量有关的许多原因，可能在条带中存在弱信号或不存在信号。这个问题可以通过使用供应商数据表中规定的理想抗原和抗体浓度和稀释度来解决。增加检测系统软件的暴露期可以解决由较低的样品和抗体浓度引起的弱带。

多条带问题

   当蛋白质被蛋白酶分解时，可能会出现与预测的低分子量条带不同的几个条带。用足够的蛋白酶抑制剂适当地制备蛋白样品可以防止大量条带的出现。由于一些蛋白质形成二聚体、三聚体和多聚体，在高分子量区域可能会出现多个条带;这个问题可以通过长时间加热样品来解决。具有翻译后修饰(PTMs)或多种亚型的蛋白质会在不同的分子量区域出现若干条带。使用特定的化学物质可以去除标本中的PTMs，这也可以去除额外的条带。

高背景

   抗体浓度高、阻断不充分、冲洗不充分以及成像时曝光时间过长均可导致印迹的高本底。修复这些问题可以避免印迹中的高背景。

不规则和不均匀的条带

   现实中会出现各种奇怪的和不平的条带，包括黑点、白色的点或条带和弯曲条带。通过有效的阻断，可以将阻断点从印迹中去除。白斑是由膜和凝胶之间的气泡形成的。当一级抗体和二抗体以显著浓度存在时，印迹中会出现白色条带。由于凝胶运行过程中使用的高电压和蛋白质的快速迁移，笑脸带出现在印迹中。通过解决这些问题，可以解决印迹中奇怪的条带。

对Western Blot相关问题的改进

   在western blotting过程中，这篇文章的不同步骤可能会有几个问题。这些问题可能源于蛋白质分析步骤，如检测低修饰或翻译后修饰的蛋白质。此外，由于抗体的质量在蛋白质的特异性检测中起着重要的作用，因此可以基于抗体的选择。由于这些问题的存在，在细胞裂解液的制备和印迹程序方面进行了各种改进，以建立可靠的结果。此外，为了实现更敏感的分析和克服与蛋白质印迹法相关的问题，几种不同的技术已经被开发和利用，如远蛋白质印迹法，扩散蛋白质印迹法，单细胞分辨蛋白质印迹法和自动化微流控蛋白质印迹法。

呈现

   研究人员使用不同的软件来处理和对齐图像切片，以优雅地呈现western blot结果。流行的工具包括Sciugo、Microsoft PowerPoint、Adobe Illustrator和GIMP。

增强免疫印迹

   自1980年以来，western blot已成为分子生物学中最常用的方法，用于确定某种蛋白质的存在和数量。多年来，已经开发了大量“先进”和“优化”的系统方法。在更先进的成像技术和现代荧光标记方法的帮助下，这些发展提供了先进和更敏感的结果。

Shift-western blot

   测定DNA结合蛋白和蛋白质-DNA相互作用的最高采用率的方法是电泳迁移位移试验。通过shift-WB分析蛋白质-DNA复合物。它是通过转移蛋白质-DNA复合物产生的，其中带电膜中的DNA位于硝化纤维素膜下方，而蛋白质则保留在膜中。然后，使用特异性抗体来识别蛋白质，并使用放射性标签来识别DNA。此外，传输的蛋白质和DNA可以被检索和更详细地检查。

单细胞western blot

   单细胞WB (scWB)是继传统WB之后，在蛋白质亚细胞定位研究和单细胞蛋白评价方面的又一突破。当测量从一个细胞到下一个细胞的蛋白质表达水平和条件时，使用它。借助单细胞WB, western blot的选择性和特异性扩展到单细胞蛋白分析。该技术克服了抗体准确性和灵敏度的局限性。此外，由于其通用性，它可以用于同时测量来自不同细胞系和单个细胞的许多靶蛋白。

定量荧光免疫印迹

   可量化荧光基荧光谱(QFWB)的发展使研究人员能够以比以往更高的灵敏度和精度进行比较表达分析。QFWB中的可量化是指真正定量的，灵敏度更高。该方法用于鉴定不同样品之间的微小表达差异。在荧光标记的二抗的帮助下，QFWB产生线性检测谱。现代QFWB技术可以同时进行双重标记，并且对识别微小变化更敏感。

定量计算机免疫印迹

   定量计算机化western blot分析单个抗体对特定抗原的反应性，使用两种方法(如WB的净条带强度和总条带强度)来鉴定免疫显性和免疫隐性决定因素。通过识别某些免疫优势抗原，可以创建快速血清诊断测试和有效疫苗。该研究利用定量计算机免疫印迹技术寻找早期诊断癌症、病毒和自身免疫性疾病的血清学标志物。

高通量免疫印迹(DigiWest)

   这是一种将传统的SDS-PAGE蛋白质分辨率与基于微球的微阵列平台相结合的技术，该平台将蛋白质固定在微球上。这种蛋白质分离，均匀性和灵敏度的组合允许快速定量许多不同的蛋白质目标及其变化。DigiWest的优势在于，western blot是使用基于微珠的微阵列进行的，允许同时检测和分析数百种不同的蛋白质及其使用各种抗体的变化。

Microfluidic western blot微流体免疫印迹

   为了在单个微流控芯片上检测多种蛋白质，需要进行微流控western blot，包括样品富集、蛋白大小、蛋白沉积、抗体原位探测等多个过程。光反应性(紫外线)聚丙烯酰胺凝胶和光模式化(蓝光)表面是这个多步骤程序的基础。由于分析性能的提高，WB现在可以在10-60分钟内完成，同时保持高灵敏度检测限(50皮摩尔)和多路成分检测水平(飞图)。因此，通过融合卓越的特异性和多路复用的高通量优势，WB为快速蛋白质组学奠定了基础。

多条带免疫印迹

   一种被称为多条带WB的增强型WB技术是基于将不同的蛋白质从多个聚丙烯酰胺凝胶条带同时转移到单个聚偏二氟乙烯或硝化纤维素膜上。多条带WB允许同时监测来自相同样品负载的多达9个单独的蛋白质，并且单个WB周期的数据输出最多增加十倍。系统生物学、细胞信号研究和生物医学诊断都将受益于这项技术。

微芯片毛细管电泳为基础的western blot

   毛细管和微芯片电泳为基础的western blot是为了减少蛋白质样品的数量和执行western blot所需的时间。它有助于在微芯片上对任何单细胞裂解物的各种蛋白质目标进行更敏感和准确的测量。400毫微克的细胞裂解液就足以鉴定和量化11种不同的蛋白质。