如何利用Strep-Tactin系统进行蛋白的表达和纯化（四）
作者：千株松生物 发布时间：2022-05-08 09:48:26点击：232
信息摘要：
为了使Strep-tag II/Strep-Tactin有效结合，我们强烈建议对与Strep-tag II融合的蛋白使用柱纯化，而不是进行分批纯化。蛋白质结合在色谱柱上是非常重要的。即使预孵育树脂和裂解物也可能会导致蛋白质产率降低。此外，延长的批次孵育会增加目标蛋白的蛋白水解降解(包括标签裂解)的风险。
Strep-tag II和Twin-Strep-tag 融合蛋白的纯化为了使Strep-tag II/Strep-Tactin有效结合，我们强烈建议对与Strep-tag II融合的蛋白使用柱纯化，而不是进行分批纯化。蛋白质结合在色谱柱上是非常重要的。即使预孵育树脂和裂解物也可能会导致蛋白质产率降低。此外，延长的批次孵育会增加目标蛋白的蛋白水解降解(包括标签裂解)的风险。
使用Strep-Tactin重力柱纯化Strep-tag II和Twin-Strep-tag融合蛋白•溶解，洗涤和洗脱缓冲液的组成可以修改以适应特定的应用，例如，通过添加0.1%吐温，5-10 mM β-巯基乙醇，或1 mM PMSF，或增加NaCl或甘油浓度。•一般建议在2-8℃进行色谱层析。根据不同的设备，这并不总是可行的，色谱层析必须在室温下进行。如果柱储存在2-8°C并转移到室温，可能会形成气泡，因为冷库中缓冲液能够在环境温度下吸收更多的气体。因此，建议在色谱柱暴露于较高温度环境后立即用在该环境温度下的平衡缓冲液平衡色谱柱。
表4。Strep-Tactin柱色谱的推荐缓冲液体积 根据色谱柱的填料结合载量调整样品体积，并在推荐的体积范围内尽可能提高样品的浓度。
1、用2 CVs(柱床体积)缓冲液w平衡Strep-Tactin色谱柱。
首先从柱上取下顶盖，然后取下柱出口的顶盖。如果按相反的顺序取下盖子，柱料可能会干掉。在添加缓冲液W以达到平衡之前，先放掉存储缓冲液。柱料不会在重力作用下干涸。使用不含EDTA的缓冲液纯化金属蛋白!
2、离心样品(14000 rpm, 5分钟，4°C，微离心机)。
储存后可能形成的不溶性聚集物可能堵塞色谱柱，因此必须去除。
3、向色谱柱中添加样品。
裂解产物的体积应在0.5和10 cv范围内(见上表)。大样本量和低浓度的目标蛋白样品可能导致产量降低，应在色谱层析前浓缩。
优先浓缩样品;如果可以定量，每1 ml CV应含有25-100 nmol重组Strep-tag®II融合蛋白的细胞提取液。
4. 在细胞提取液完全进入色谱柱后，用1CV缓冲液W洗涤色谱柱5次。每1 CV大小洗脱液收集一管。将第一个洗涤组分的2µl和随后每个洗涤组分的20µl留作SDS-PAGE检测用。
5. 加入6倍0.5 CV缓冲液E，以0.5 CV馏分收集洗脱液。每个组分留20µl样品用于SDS-PAGE分析。大多数纯化的Strep-tag II融合蛋白通常在第2至第5组分洗脱液中。必要时，可以通过透析或凝胶层析去除脱硫生物素和EDTA。
问题处理
使用蛋白酶缺乏的大肠杆菌表达菌株。细胞裂解过程中使用蛋白酶抑制剂。
与蛋白另一端融合Strep-tag II;使用其它linker。
确保Strep-tag II不与被加工的部分蛋白相关。避免在不连续的分批模式下纯化。长时间的分批孵育增加了目标蛋白水解降解的风险，包括标签的切割。
减少洗涤量至3 CVs或使用与StrepTactin XT蛋白偶联的树脂。
用HABA检查色谱柱的结合能力。在将HABA添加到色谱柱上后，HABA的颜色应该从黄色切换到橙色。为了避免因生物素/生物素化蛋白而使色谱柱失活，如果要纯化含有生物素的提取物，请在细胞裂解液中加入亲和素(或生物素阻断缓冲液)。总大肠杆菌细胞裂解液中可溶部分的总生物素含量约为1nmol / L (OD550= 1.0)。每1nmol生物素添加2-3 nmol亲和素单体。
“污染的蛋白质”
注:大肠杆菌总细胞提取物的可溶部分不含蛋白质，除了几乎不可逆结合的生物素羧基载体蛋白(BCCP)，该蛋白与 Strep-Tactin色谱柱显著结合。因此，污染蛋白与重组蛋白本身特异性或非特异性相互作用，从而共同纯化。
使用蛋白酶缺乏的大肠杆菌表达菌株。细胞裂解后加入蛋白酶抑制剂。将Strep-tag II与蛋白其它末端融合。检查是否存在内部翻译起始位点(仅在C端Streptag II的情况下)或过早终止位点(仅在N端Streptag II的情况下)。在另一端添加6x Histidine标签，并使用这两个标签进行纯化，从而得到全长蛋白。
增加所有缓冲液的离子强度，用于细胞裂解和色谱纯化(高达1M NaCl)或添加温和的洗涤剂(0.1% Triton X-100, 0.1% Tween, 0.1% CHAPS等)。
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